CNV在動(dòng)物研究中的案例分析2

發(fā)稿時(shí)間：2016-04-13來源：天昊生物

英文題目：Bovine NK-lysin: Copy number variation and functional diversification
期刊名：PNAS
影響因子：9.674
研究背景：
       抗菌肽（AMP）是先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，它在整個(gè)生命周期都廣泛存在。人粒溶素（GNLY）和豬NK-lysin是同源基因，都屬于抗菌肽（AMP），它們?cè)诘挚苟喾N微生物，包括革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌，真菌，原蟲，病毒，甚至腫瘤細(xì)胞都是非常有效的。NK-lysin的同源基因已經(jīng)在許多物種中被鑒定到，包括人，豬，牛，馬和幾種鳥類。在人類及其它大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，NK-lysin是單基因，而牛的NK-lysin是十幾年前第一個(gè)被報(bào)道的，當(dāng)時(shí)從四種不同奶牛中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)NK-lysin cDNA片段（Bo-lysin 89和Bo-lysin 62），但是目前還不清楚這兩個(gè)片段是來自兩個(gè)不同的NK-lysin基因還是來自同一個(gè)NK-lysin基因的等位基因。
       拷貝數(shù)變異（CNV）是一種常見的動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)變異。過去已經(jīng)針對(duì)不同品種的牛進(jìn)行了全基因組CNV分析，其中兩個(gè)研究表明，牛NK-lysin基因處于一個(gè)CNV區(qū)域。高度一致（90%）的重復(fù)（> 1 Kb）被稱為“片段復(fù)制”，片段復(fù)制在哺乳動(dòng)物基因組中是非常常見的，它是基因家族擴(kuò)張的主要機(jī)制之一。奶?；蚪M測(cè)序顯示和人及小鼠一樣奶牛中的許多免疫相關(guān)基因拷貝數(shù)也得到擴(kuò)張，這其中就包括抗菌肽，β-防御素，C型溶菌酶和脂多糖結(jié)合蛋白，這些基因家族的擴(kuò)張可能會(huì)產(chǎn)生新的功能基因，從而影響反芻動(dòng)物胃中的獨(dú)特生理或群體環(huán)境中的疾病抵抗能力。
研究材料： 4頭荷斯坦牛；CHORI-240 Bovine BAC文庫(kù)；5個(gè)組織（肺、胸腺、脾臟、呼吸淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)）
技術(shù)平臺(tái)： PacBio RS三代測(cè)序，一代測(cè)序，qPCR，抑菌實(shí)驗(yàn)
研究思路：
       通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到7個(gè)不同NK-lysin序列；
       系統(tǒng)發(fā)育分析把它們分為4個(gè)不同的NK-lysin基因；
       克隆測(cè)序驗(yàn)證NK2A, NK2B, NK2C是否真實(shí)存在；
       BAC克隆重測(cè)序鑒定牛科4個(gè)NK-Lysin基因；
       鑒定NK-Lysin家族基因組結(jié)構(gòu)和CNV斷點(diǎn)；
       一代測(cè)序驗(yàn)證本次得到的 Bo-NK contig精確性；
       ?？?em>NK-Lysin家族的遺傳結(jié)構(gòu)分析；
       ?？?em>NK-Lysin家族的重復(fù)序列分析；
       qPCR檢測(cè)?？?em>NK-Lysin基因在不同組織中的表達(dá)；
       ?？芅K-Lysin多肽的抗菌效果；
研究結(jié)果：
?？?/strong>NK-lysin純合性分析
       通過尋找NCBI脫氧核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定到7個(gè)不同NK-lysin序列，序列的系統(tǒng)發(fā)育分析可以把它們分為4個(gè)分支，分別代表4個(gè)不同的NK-lysin基因（NK1, NK2A, NK2B, NK2C）（Fig. S1），其中NK1, NK2A, NK2B彼此密切相關(guān)，而與NK1有顯著不同。

Fig. S1. 7個(gè)不同NK-lysin序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

       其中NK1 和 NK2A在?？茀⒖蓟蚪MUMD 3.1中分別被注釋為uncharacterized LOC616323和 Bovine GNLY，這兩個(gè)基因在11號(hào)染色體上串聯(lián)排列。而NK2B, NK2C在牛參考基因組中是不存在的。為了確認(rèn)NK2A, NK2B, NK2C的真實(shí)性，針對(duì)這幾個(gè)基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，為了減少等位基因變異在分析中的影響，基于770K HD SNP芯片分型結(jié)果選擇了NK-lysin區(qū)域及側(cè)翼兩個(gè)基因（ATOH8和SFTPB）是純合子的4頭荷斯坦牛（2527, 2796, 2822, 3850）用于下一步的分析。結(jié)果從這4個(gè)個(gè)體中共得到5個(gè)不同的序列（Fig. 1），這5個(gè)序列形成3個(gè)分支，分別對(duì)應(yīng)NK2A，NK2B，NK2C。這3個(gè)分支與NK1有明顯的不同。在個(gè)體2527中檢測(cè)到NK2A的兩條序列，如果個(gè)體2527在NK-lysin區(qū)域是純合的，那么在牛中NK2A至少存在兩個(gè)拷貝。在個(gè)體2822和3850中沒有發(fā)現(xiàn)NK2B相關(guān)克隆，并且使用NK2B特異基因引物不能得到其擴(kuò)增子，說明在這兩個(gè)個(gè)體中不存在NK2B。
 

Fig. 1. 在4個(gè)純合個(gè)體（2527, 2796, 2822, 3850）中進(jìn)行NK2A, NK2B, NK2C序列分析。對(duì)牛的NK-lysin 參考序列（NK1, NK2A, NK2B, NK2C），豬同源序列（Horse-NKL），馬同源序列（Horse-NKL）和來源于4個(gè)個(gè)體的5個(gè)不同克隆序列（Seq. 1–5）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

BAC克隆測(cè)序鑒定4個(gè)NK-Lysin基因
       通過對(duì)覆蓋NK-Lysin區(qū)域的兩個(gè)重疊BAC克隆進(jìn)行測(cè)序來確定牛科NK-Lysin家族的精確基因數(shù)目和基因組構(gòu)成，這兩個(gè)BAC克隆分離于CHORI-240 Bovine BAC文庫(kù)，然后使用PacBio RS進(jìn)行測(cè)序。通過兩輪測(cè)序，平均覆蓋深度達(dá)到1310-1551×，因?yàn)檫@兩個(gè)文庫(kù)有重疊，所以對(duì)序列進(jìn)行了de novo組裝，得到兩個(gè)contig，這兩個(gè)contig有2 kb的完全重疊區(qū)域。然后這兩個(gè)contig被組裝成一個(gè)長(zhǎng)度227,063 bp，覆蓋整個(gè)NK-Lysin區(qū)域的supercontig。這個(gè)組裝結(jié)果（Bo-NK）要比目前?；蚪M189,124 bp （Bos_taurus_UMD_3.1）的組裝結(jié)果長(zhǎng)了38 kb，而這個(gè)長(zhǎng)度上的區(qū)別主要由參考基因組的錯(cuò)誤組裝引起的。
鑒定NK-Lysin家族基因組結(jié)構(gòu)和CNV斷點(diǎn)
       針對(duì)本次得到的Bo-NK supercontig 進(jìn)行散點(diǎn)圖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了3個(gè)具有95%相似性的片段復(fù)制（SD-NK2A；SD-NK2B；SD-NK2C），每一個(gè)片段復(fù)制都包含一個(gè)NK-lysin基因，NK1位于NK2C下游41.8 kb ，并且SD-NK2C長(zhǎng)度要比SD-NK2A 和 SD-NK2B短，（Fig. 2B）。連接點(diǎn)4（JP-4）序列和其它三個(gè)連接點(diǎn)（JP-1，JP-2，JP-3）相比有所不同（Fig. 2C）。

Fig. 2. PacBio 對(duì)BAC 克隆的測(cè)序分析。（A） 本次得到的Bo-NK supercontig序列和原來基因組序列 （Bos_taur-us_UMD_3.1.1）的比較結(jié)果。錯(cuò)配 （垂直的藍(lán)線）；內(nèi)部重復(fù)（灰盒）；4個(gè)NK-lysin 基因位置 （箭頭） 。（B） 針對(duì)本次得到的 Bo-NK supercontig 進(jìn)行散點(diǎn)圖分析 。（C）NK-Lysin家族的基因組結(jié)構(gòu)和鑒定到的斷點(diǎn)。JP-2的側(cè)翼序列作為參考序列。

一代測(cè)序驗(yàn)證本次得到的 Bo-NK contig精確性
       為了確定本次得到的Bo-NK contig精確性，在每個(gè)連接點(diǎn)（JP）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行驗(yàn)證（以CHORI-240 Bovine BAC文庫(kù)的供體DNA作為模板），一代測(cè)序后發(fā)現(xiàn)JP-1，JP-3，JP-4 的PCR產(chǎn)物與三代測(cè)序得到的Bo-NK contig完美一致。
NK-Lysin家族的遺傳結(jié)構(gòu)分析
       通過對(duì)這4個(gè)NK-Lysin的基因組序列進(jìn)行比對(duì)來確定其遺傳結(jié)構(gòu)（Fig.S2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4個(gè)NK-Lysin基因都包含5個(gè)外顯子，并且這些外顯子的大小相差不多，但是NK1的內(nèi)含子要大于其它3個(gè)基因的內(nèi)含子。NK2A，NK2B，NK2C 相互之間有95%相似性，但是與NK1只有85% 的相似性。通過對(duì)這4個(gè)NK-Lysin以及人類、豬、馬、羊同源基因編碼序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)只在反芻動(dòng)物存在NK-Lysin基因家族的擴(kuò)張。

Fig. S2. 4個(gè)NK-Lysin基因組序列的比對(duì)

牛NK-Lysin基因家族的重復(fù)序列分析
       在人類基因家組中，重復(fù)序列經(jīng)常是與重組熱點(diǎn)是關(guān)聯(lián)的，另外與斷點(diǎn)處重復(fù)序列錯(cuò)配引起的染色體不穩(wěn)定也是相關(guān)的。深入分析了NK-Lysin區(qū)域內(nèi)重復(fù)元件的分布（Fig. 3A）?？傮w來說每個(gè)斷點(diǎn)處下游區(qū)域要比上游區(qū)域具有更多的重復(fù)，NK1的側(cè)翼序列重復(fù)度更高，它包含一個(gè)大的長(zhǎng)的，分散的細(xì)胞核元件（LINES），這與其它3個(gè)基因有明顯不同。數(shù)個(gè)重復(fù)家族位于NK-Lysin區(qū)域內(nèi)，包括2個(gè)L1家族，2個(gè)LTR家族，4個(gè)?？铺禺惖模痰?，分散的細(xì)胞核元件（SINE）家族（BOVTA，BTALUL2，CHR-2_BT，CHR-2A）。接著繪制了每個(gè)斷點(diǎn)處上游或下游5 kb內(nèi)牛科重復(fù)家族的分布圖（Fig. 3B）。JP-1，JP-2，JP-3 下游臨近區(qū)域富集了SINES，特別是BOVTA元件。BOVTA元件組成了一個(gè)?？铺禺愔貜?fù)家族，這與人類片段復(fù)制相關(guān)的ALU重復(fù)家族非常類似，表明片段側(cè)翼的斷點(diǎn)具有很高的同源性，這有助于減數(shù)分裂時(shí)的不平等交換和?？?em>NK-Lysin基因家族結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。

Fig. 3. 重復(fù)元件分析。（A）組裝好的supercontig Bo-NK內(nèi)重復(fù)元件的分布，四個(gè)斷點(diǎn)和基因如圖所示。（B） 每個(gè)斷點(diǎn)處上游或下游5 kb內(nèi)SINEs的分布圖。

?？?/strong>NK-Lysin基因的組織特異性表達(dá)
       為了檢測(cè)?？?em>NK-Lysin基因是否都表達(dá)，分別在5個(gè)組織（肺、胸腺、脾臟、呼吸淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)）中檢測(cè)了這些基因的表達(dá)量。qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4個(gè)NK-Lysin基因都表達(dá)，但是每個(gè)基因表達(dá)都表現(xiàn)出組織特異性（Fig. 4）：NK1 和NK2A在腸淋巴結(jié)高表達(dá)但是在肺中低表達(dá)；NK2B在各組織中都表達(dá)，但在腸淋巴結(jié)和肺中高表達(dá)；NK2C則在肺中表達(dá)量最高。

Fig. 4. NK-Lysin在肺（L）、胸腺（T）、脾臟（S）、呼吸淋巴結(jié)（RLN）、腸淋巴結(jié)（IPP）中的基因表達(dá)。

?？?/strong>NK-Lysin多肽的抗菌效果
       使用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌對(duì)4種NK-Lysin多肽的抗菌效果進(jìn)行了測(cè)試，這4種NK-Lysin多肽在納摩爾濃度對(duì)這兩種菌株的抑菌效果都是有效的（Fig. 5A）。接著使用透射電鏡觀察了NK-Lysin多肽對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的作用效果（Fig. 5B），結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有經(jīng)過NK-Lysin多肽處理的細(xì)胞呈現(xiàn)完整的細(xì)胞形態(tài)，例如保持一個(gè)完整的細(xì)胞膜和充足的細(xì)胞質(zhì)；而經(jīng)過NK-Lysin多肽處理的細(xì)胞則呈現(xiàn)周質(zhì)空間膨脹和細(xì)胞質(zhì)收縮，這表明這4種?？芅K-Lysin多肽具有明顯的抗菌效果。

Fig. 5. （A） 4種NK-Lysin多肽對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌效果。（B） 透射電鏡觀察NK-Lysin多肽對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的作用效果，（a） 對(duì)照細(xì)胞；（b）5 μM NK-Lysin多肽處理20分鐘后的細(xì)胞。