使用宏基因組測(cè)序診斷阿米巴原蟲腦炎

發(fā)稿時(shí)間：2016-09-02來源：天昊生物

英文題目：Diagnosing Balamuthia mandrillaris Encephalitis with Metagenomic Deep Sequencing

中文題目：使用宏基因組測(cè)序診斷阿米巴原蟲腦炎

期刊名：Annals of Neurology    發(fā)表時(shí)間：2015        IF：9.6 

技術(shù)：宏基因組測(cè)序

測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq2500測(cè)序平臺(tái)(PE135)

材料：一例開始有眼內(nèi)炎，隨后有腦膜炎的74歲女性患者，使用宏基因組測(cè)序?qū)ζ淠X脊液（CSF）進(jìn)行鑒定，以確定感染性病原體。

研究背景:

目前診斷腦膜腦炎病因面臨重要的挑戰(zhàn)，這是由于各種細(xì)菌，病毒，真菌，寄生蟲，可以產(chǎn)生重疊的臨床表型，常常會(huì)延誤診斷和治療。目前許多病原體的特異血清學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）有檢測(cè)昂貴，費(fèi)時(shí)，并有不易操作等缺點(diǎn)，而宏基因組測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)不常見或新的病毒，因此非常適合用于腦膜腦炎病因的診斷。

病例報(bào)告:

病人有過用硫酸羥氯喹治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病史；沒有使用過煙草，酒精，和毒品；在本院治療前4周，病人曾經(jīng)在其它3所醫(yī)療機(jī)構(gòu)治療過，每個(gè)機(jī)構(gòu)都診斷其有間歇性發(fā)熱和輕度精神狀態(tài)改變癥狀，在第二個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)被診斷為眼內(nèi)炎，并用萬古霉素，頭孢他啶和伏立康唑治療過。

使用PCR對(duì)單純皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒，弓形體病的玻璃狀液檢測(cè)結(jié)果呈陰性。腦磁共振結(jié)果顯示有很多的環(huán)形增強(qiáng)和幕上和幕下病變的擴(kuò)散受限，被認(rèn)為符合膿腫以及重度梗阻性腦積水。血液，尿液和腦脊液的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)結(jié)果都是陰性的。腦脊液的神經(jīng)梅毒，肺結(jié)核和隱球菌科的檢測(cè)結(jié)果也是陰性(Table1)。弓形蟲病在腦脊液和血清學(xué)的檢查結(jié)果也是陰性。

盡管使用了光譜抗生素，病人的病情惡化，在16天后逐步喪失活動(dòng)能力和腦干反射能力。在住院的第10天，重復(fù)腰椎穿刺顯示惡化的細(xì)胞增多，同時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞增多癥更加突出(Table1)。鑒于這些結(jié)果，在住院的第10天停止了廣譜抗生素治療，開始抗結(jié)核和抗真菌治療。第4天的腦活檢沒有明確的診斷，只揭示了有輕微膠質(zhì)細(xì)胞增生和無炎性細(xì)胞或微生物侵入。7天后的第二次腦活檢發(fā)現(xiàn)了病因不明的嚴(yán)重壞死性血管炎，同時(shí)伴隨嗜酸性粒細(xì)胞，慢性炎性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增多，但是沒有明顯的肉芽腫性成分。在住院的第14天的重復(fù)腦磁共振成像顯示，病人腦病變的數(shù)量和大小明顯增多，以及基底性腦膜炎的間隔發(fā)展（Fig B，C）。病人日益加重的腦水腫使用高滲性治療和外部排水變得愈加困難。這個(gè)患者的血流動(dòng)力學(xué)最終變得很不穩(wěn)定，這可能是由于顱內(nèi)壓升高，并要求多個(gè)升壓藥造成的。病人家屬最終選擇了舒適護(hù)理，病人在住院的第17天去世。

表1：傳染病診斷試驗(yàn)結(jié)果。

研究結(jié)果：

在腦脊液中鑒定阿米巴原蟲序列

病人樣本的宏基因組測(cè)序共產(chǎn)生19,642,962 PE reads，大約有5.2G數(shù)據(jù)。PE reads首先使用PriceSeqFilter進(jìn)行質(zhì)量過濾，然后與人類基因組hg19進(jìn)行比對(duì)，沒有比對(duì)上人類基因組hg19有33,093條reads，占原始數(shù)據(jù)的0.1%。然后通過和NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫比對(duì)確定潛在的病原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)97%的序列比對(duì)上脊椎動(dòng)物序列和已知的實(shí)驗(yàn)室污染物序列。

過濾完后，發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲是豐度最高的物種，其中81個(gè)reads比對(duì)上NCBI上3個(gè)已知的阿米巴原蟲基因。而一個(gè)水對(duì)照樣本則沒有發(fā)現(xiàn)可以比對(duì)上阿米巴原蟲的序列。使用比對(duì)上阿米巴原蟲基因序列的30個(gè)reads進(jìn)行組裝，最終生成一個(gè)806nt的contig，這個(gè)contig能比對(duì)上阿米巴原蟲的16S核糖體基因(GenBank accession number KP990616)。

對(duì)宏基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

使用各種方法驗(yàn)證了阿米巴原蟲的存在。使用PCR在甲醛固定的第二次腦活檢組織、腦脊液、受感染的眼睛玻璃體液鑒定到了阿米巴原蟲的18s核糖體基因。使用病人第二次腦活檢組織更多切片進(jìn)行重新評(píng)估，發(fā)現(xiàn)的微生物與血管內(nèi)的阿米巴原蟲相同，并且阿米巴原蟲已經(jīng)延伸到神經(jīng)組織(Fig D)。在疾病預(yù)防控制中心傳染病病理科對(duì)腦活檢組織中的阿米巴原蟲進(jìn)行免疫組化檢測(cè)(Fig E)，發(fā)現(xiàn)了大量活的阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。使用血清學(xué)方法對(duì)腦活檢組織中的阿米巴原蟲檢測(cè)發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈陽性(Table1)。

圖1：神經(jīng)影像學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)。（A）軸向T2加權(quán)/液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（FLAIR）腦磁共振成像（MRI）顯示多個(gè)高信號(hào)（箭頭），分別對(duì)應(yīng)擴(kuò)散加權(quán)成像上的受限擴(kuò)散區(qū)域。（B）軸向T2加權(quán)/液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列（FLAIR）腦磁共振成像（MRI）顯示多個(gè)高信號(hào)的大小和數(shù)目。（C）增強(qiáng)軸位T1加權(quán)MRI顯示多個(gè)環(huán)形強(qiáng)化病變（白色箭頭），基底腦膜炎（黃色箭頭）以及重度腦積水。（D）腦實(shí)質(zhì)過碘酸-希夫染色切片顯示了壞死性血管炎，慢性炎性細(xì)胞，和大量類似巨噬細(xì)胞的阿米巴滋養(yǎng)體（箭頭）；大多數(shù)的組織顯示一個(gè)強(qiáng)烈伴隨混合性炎癥的壞死性血管炎伴，包含了大量巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。（E）免疫組織化學(xué)顯示了大量活的阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。

結(jié)果總結(jié)：

通過宏基因組測(cè)序在腦脊液中鑒定到能比對(duì)上阿米巴原蟲核糖體RNA基因的序列。隨后的PCR反應(yīng)確認(rèn)了阿米巴原蟲在腦脊液、腦組織和受感染的眼睛玻璃體液中的存在。血清學(xué)和免疫組化對(duì)腦活檢組織中阿米巴原蟲的檢測(cè)也呈陽性。因此宏基因組測(cè)序是一個(gè)功能強(qiáng)大的診斷工具，能夠快速鑒定病原菌，從而為早期靶向治療提供幫助。

文章亮點(diǎn)：

本文患者對(duì)血液，尿液和腦脊液通過許多病原體的特異血清學(xué)和PCR檢測(cè)結(jié)果均呈陰性，而通過宏基因組測(cè)序在腦脊液中則鑒定阿米巴原蟲，這個(gè)結(jié)果通過其它方法檢測(cè)也得到了驗(yàn)證，說明宏基因組測(cè)序因?yàn)榭梢园l(fā)現(xiàn)不常見或新的菌種，因此在腦膜腦炎病因診斷方面有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。