天昊生物客戶發(fā)表CO2改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)的文章

發(fā)稿時(shí)間：2017-01-20來源：天昊生物

中國科學(xué)院地理與湖泊研究所史小麗課題組，近期在《Fundamental and Applied Limnology》上發(fā)表了CO₂改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測序工作和生物信息學(xué)分析。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：CO₂ alters picophytoplankton community structure in fresh water ecosystems

中文題目：CO₂改變淡水生態(tài)系統(tǒng)中微微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)

期刊名：Fundamental and Applied Limnology      發(fā)表時(shí)間： 2016年11月

研究背景: 大氣CO₂濃度從工業(yè)化前的280 ppm增加到現(xiàn)在的400 ppm，預(yù)計(jì)到下一世紀(jì)將翻一番，達(dá)到750 ppm。最近研究指出，60%富營養(yǎng)化湖泊的CO₂是不飽和的，富營養(yǎng)和碳限制在淡水系統(tǒng)是很常見的。由于地球上的大多數(shù)湖泊很淺且易受水運(yùn)動影響，這就決定了空氣和水之間CO₂的流動。因此，大氣CO₂濃度增加可能對這些富營養(yǎng)化的淡水生態(tài)系統(tǒng)有重要影響。微微型浮游植物（小于3μm）包括picocyanobacteria和photosynthetic picoeukaryotes(PPEs)，它們分布廣泛，并且在許多湖泊和海洋碳循環(huán)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們分別在淡水和海洋系統(tǒng)中可以占到總?碳?生產(chǎn)的16% - 70%和1?%- 90 %。?但是目前關(guān)于這些微微型浮游植物對CO₂變化的響應(yīng)以及這些響應(yīng)對整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的作用仍然是未知的。

研究目的:調(diào)查 CO₂濃度升高如何改變微微型浮游植物的群落結(jié)構(gòu)以及具體哪個(gè)微微型浮游植物物種對CO₂濃度升高是敏感的

 

技術(shù)：18S rRNA擴(kuò)增子測序，V4區(qū)

測序平臺：Illumina MiSeq測序平臺

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

實(shí)驗(yàn)在東湖太湖生態(tài)?站?進(jìn)行。湖水通過100μ米孔徑的尼龍篩去除大浮游動物和碎片，然后被泵入九個(gè)白色塑料容器中（200升）。容器放置在東湖生態(tài)站的人工池塘中來模擬當(dāng)?shù)氐臏囟群凸庹账?。每天向容器中補(bǔ)充定量的溶解性營養(yǎng)（KH₂PO₄，NH₄Cl，NaNO₃），使之保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，以避免營養(yǎng)的影響，從而集中觀測CO₂處理的影響。分別進(jìn)行三種不同CO₂水平的處理：270 ppm，380 ppm和750 ppm，從而分別模仿工業(yè)化前，當(dāng)前和未來（2100年）的CO₂濃度。每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行了四次獨(dú)立觀測：分別在2013年8月（夏季），2013年11月（秋季），2014年1月（冬季），2014年4月（春季），從而比較在這4個(gè)不同季節(jié)微微型浮游植物對CO₂變化的響應(yīng)。

理化參數(shù)：

每天使用水質(zhì)分析儀測定硝態(tài)氮（NO₃^?–），銨（NH₄⁺）和磷酸鹽（PO₄^3?–）濃度。每天補(bǔ)充各養(yǎng)分以確保容器和湖之間的營養(yǎng)水平一致，現(xiàn)場使用多參數(shù)測量儀測定水溫，溶解氧（DO），pH值和電導(dǎo)率。每3天水樣品在上午8:00-10:00運(yùn)到岸邊實(shí)驗(yàn)室被立即預(yù)處理，被過濾得到的水次級樣品立即用來測定葉綠素a（Chl-a）和堿度（ALK）。水中的pCO2根據(jù)pH值和堿度（ALK）進(jìn)行估計(jì)。

葉綠素a含量分析：

通過熒光分光光度法測定葉綠素a含量來估計(jì)浮游植物生物量。每個(gè)容器100?–?200?毫升水次級樣本通過3μm Millipore濾膜過濾兩次，然后再經(jīng)過0.2μM Millipore濾膜過濾。分別對通過3μm和0.2μM膜過濾得到的大型浮游植物和微微型浮游植物進(jìn)行葉綠素a含量測量。

DNA提取和18S rRNA擴(kuò)增子測序：

使用DNeasy Blood and Tissue Extraction Kit (Qiagen)提取hotosynthetic picoeukaryotes (PPEs)DNA。使用真核生物V4區(qū)進(jìn)行18S rRNA擴(kuò)增子測序。

研究結(jié)果：

化學(xué)環(huán)境

實(shí)驗(yàn)容器中的可溶性營養(yǎng)物質(zhì)濃度與附近的湖是相似的。硝態(tài)氮是主要的溶解態(tài)氮組分。銨濃度最高是在春天，達(dá)到0.12毫克/升（表1）。磷酸鹽濃度在0.075毫克/升-0.17毫克/升變化（表1）。

不同水平CO2處理引起實(shí)驗(yàn)容器中水溶解CO₂濃度的變化，低濃度CO₂處理導(dǎo)致水溶解CO₂濃度也相對較低（圖1a）。pH值的季節(jié)性變化也較大，秋季最低為6.7，夏天最高為9.8，水溶解CO₂濃度升高會導(dǎo)致所有季節(jié)水pH值下降（秋季除外）。

表1四個(gè)不同季節(jié)容器內(nèi)養(yǎng)分的濃度測定

圖1 四個(gè)季節(jié)中不同濃度CO₂處理下水樣本pH值和溶解性CO₂濃度

微微型浮游植物豐度

微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻(xiàn)在不同季節(jié)之間差異很大，夏季最低達(dá)到18%，冬季最高為79%，然而不同濃度CO2處理之間微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻(xiàn)卻沒有差異（表2）。

表2 微微型浮游植物對浮游植物葉綠素生物總量的貢獻(xiàn)百分比

通過流式細(xì)胞儀對兩種微微型浮游植物進(jìn)行鑒定：一組是Phycocyanin-rich picocyanobacteria，它具有豐富的藻藍(lán)蛋白，是由PC細(xì)胞構(gòu)成；另一組是photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)，則含有豐富的葉綠素a（圖2）。

圖2微微型浮游植物的流式細(xì)胞分布。暗紅色熒光：Phycocyanin-rich picocyanobacteria富含藻藍(lán)蛋白；紅色熒光：PPE富含葉綠素a

通過流式細(xì)胞技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在春天，PC細(xì)胞經(jīng)歷了爆炸性增長，密度從24×10³個(gè)細(xì)胞/微升漲至1280×10^3?細(xì)胞/微升（圖3a）。在夏天，第21天達(dá)到頂峰，密度達(dá)到1000×10^3?細(xì)胞/微升（圖3b）。在秋天，PC細(xì)胞只有在最后一天才表現(xiàn)出明顯的增長（圖3c）。在冬天，PC細(xì)胞的濃度太低沒有被檢測到。

在春季和秋季，PPES濃度在結(jié)束階段表現(xiàn)出持續(xù)的增長（圖3d，3f）。在夏季的早期階段，PPES濃度迅速增加，在第6天達(dá)到最大值，然后下降（圖3e）?？傮w來說，春季PPEs含量最高，冬季PPEs含量最低（圖3g）。在春季試驗(yàn)后期，PPEs的細(xì)胞密度在高濃度CO₂處理下顯著較高（圖3d）,而在冬季，PPEs的細(xì)胞密度在高濃度CO₂處理下則顯著較低。

圖3 四個(gè)季節(jié)中不同濃度CO₂處理下PC細(xì)胞與PPES濃度的變化

PPEs群落組成

首先通過流式細(xì)胞技術(shù)將PPEs分選出來，然后通過18SrDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)對春季和冬季不同濃度CO₂處理下的PPEs群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPEs的162個(gè)OTUs可以歸類為Cryptophyta（隱藻門）, Haptophyta（定鞭藻門）, Stramenopiles（不等鞭毛門）, Chlorophyta（綠藻門）等。其中，Chlorophyta（綠藻綱）和Chrysophyceae（金藻綱）占總序列數(shù)的比例居多，大約占30%（圖4）。春季和冬季PPEs的群落結(jié)構(gòu)主要差異是：Bacillariophyceae（硅藻綱）只在春天可以發(fā)現(xiàn)（圖4）。

圖4 春季和冬季PPEs的群落結(jié)構(gòu)

PPEs的群落組成在春季和冬季非常相似，有100個(gè)共有的OTUs，分別有30個(gè)OTUs不同（圖5）。在春季，3個(gè)不同濃度CO₂處理共有78個(gè)OTUs，一個(gè)金藻綱OTU顯示對CO₂濃度變化十分靈敏（表4），其比例隨著CO₂濃度上升而減少。在冬季，3個(gè)不同濃度CO₂處理共有55個(gè)OTUs（圖5），一個(gè)衣藻屬OTU，其比例隨著CO₂濃度上升而減少（表4）。2個(gè)隱藻門OTU比例隨著CO₂濃度上升而減少。2個(gè)金藻綱OTU比例隨著CO₂濃度上升而上升（表4）。

表4   不同濃度CO₂處理下豐度有差異的OTU

圖5 不同季節(jié)或不同濃度CO2處理下的OTUs韋恩圖分析

總結(jié)：

1.         微微型浮游植物占東太湖浮游植物的主要部分，它們的葉綠素a含量最多貢獻(xiàn)了冬季葉綠素a總量的79%。

2.         Phycocyanin-rich picocyanobacteria（PC細(xì)胞）占東太湖微微型浮游植物群落的主要部分（冬季除外）。

3.         PC細(xì)胞濃度對CO₂濃度的改變不敏感；與此相反，在春季，CO₂濃度升高能顯著增加photosynthetic picoeukaryotes (PPEs)的豐度，但是在冬季則降低了PPEs的豐度。

4.         使用18SrDNA擴(kuò)增子測序?qū)Υ杭竞投静煌瑵舛菴O₂處理下PPEs樣品進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明Chlamydomonas（衣藻綱）和Cryptophyceae（隱藻綱）不受高濃度CO₂處理青睞，其比例隨著CO₂濃度上升而減少；而Chrysophyceae（金藻綱）則受惠于CO₂濃度增長，其比例隨著CO₂濃度上升而增加。

 

關(guān)于天昊：

      天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細(xì)菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進(jìn)行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴(kuò)增，保證每個(gè)樣品擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內(nèi)誤差；數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效序列Q30達(dá)到80%以上；加上最新升級的分析內(nèi)容和解釋詳盡的結(jié)題報(bào)告，帶您享受極致的微生物擴(kuò)增子測序體驗(yàn)。