Nature Communication：動脈粥樣硬化性心血管疾病患者腸道菌群宏基因組研究

發(fā)稿時間：2017-11-01來源：天昊生物

副標題：首個大隊列動脈粥樣硬化人群宏基因組研究

英文題目：The gut microbiome in atherosclerotic cardiovascular disease

中文題目：動脈粥樣硬化性心血管疾病患者腸道菌群宏基因組研究

期刊名：Nature Communication       發(fā)表時間： 2017.10           影響因子： 12.123

研究對象：

宏基因組測序：218例動脈粥樣硬化性心血管疾病患者（ACVD）和187例健康對照者的糞便樣本，PE100測序。去除低質量序列和人類DNA后，有2.2 Tb高質量序列（平均每個樣本得到55.2M序列）能比對到腸道菌群參考基因集（含有9.9百萬個基因），每個樣本的序列平均有80.0 ±3.5%能夠比對上。

研究背景： 

心血管和代謝性疾病統(tǒng)稱為心臟疾?。?/span>CMD），其具有高發(fā)病率和死亡率，并且耗費相當高的醫(yī)療費用。目前腸道微生物組已經成為影響人類健康和疾病的關鍵因素，心臟疾病也不例外。宏基因組學測序研究已經揭示糖尿病和肥胖患者腸道菌群特征。然而目前只針對很小樣本量的心血管病患者進行了腸道菌群分析。以前的研究表明，腸道菌群代謝物膽堿，磷脂酰膽堿和L-肉堿能產生三甲胺（TMA），而三甲胺在肝臟中被氧化為三甲胺-N-氧化物（TMAO）。目前通過抑制依賴腸道菌群TMAO的產生被證明是一種治療動脈粥樣硬化

很有前途的策略。然而，CMD大型隊列宏基因組學研究的缺乏嚴重阻礙了對微生物作用的進一步探索研究。

研究結果：

1、 動脈粥樣硬化性心血管疾病患者（ACVD）腸道微生物組成

PCA和dbRDA分析表明健康組和ACVD患病組在一些主要菌屬上存在明顯豐度差異（圖1）。例如Bacteroides和Prevotella在ACVD患者中減少，Streptococcus和Escherichia在ACVD患者中增加（圖1B）。但是兩組間在基因豐度和基因多樣性沒有明顯差異。

 

圖1. ACVD患者腸道主要菌群。A 屬水平腸道菌群PCA分析。218個患者中有205個穩(wěn)定型心絞痛、8個不穩(wěn)定心絞痛、5個急性心肌梗死。B 前20個最豐富菌屬的相對豐度，兩組間有差異菌屬用顏色標注。紅色或青色, q-value <0.01; 淺紅色或綠色, q-value <0.05; 黑色, q-value ≥0.05。C屬水平腸道菌群dbRDA分析。

2、 與ACVD相關的菌種和菌株

基于來自同一個微生物基因連鎖的原則，根據(jù)基因豐度的共同變化將所有樣本990萬個基因聚集成為2982個MLG（MLG >100個基因）。這是目前為止基于豐度聚類得到的最大基因集，同時也是最大隊列人群。組間共有536個豐度差異的MLG，占到所有MLG相對豐度的56.3%。其中320個MLG在ACVD患者中更豐富。

l 腸桿菌科細菌如Escherichia coli, Klebsiella spp.,和Enterobacter aerogenes在ACVD患者中豐度更高（圖2）。

l 存在于口腔內的細菌，如Streptococcus spp., Lactobacillus salivarius, Solobacterium moorei, Atopobium parvulum在ACVD患者中比健康對照組豐度更高。

l 與炎癥性腸炎和腸道微生物低豐度相關的Ruminococcus gnavus在ACVD患者中比健康對照組豐度更高。

l 以前報道過的能降低心臟病藥物地高辛活性的Eggerthella lenta在ACVD患者中豐度更高

l 丁酸鹽產生細菌包括Roseburia intestinalis和Faecalibacterium cf. prausnitzii在ACVD患者中豐度更低。

l 腸道常見細菌例如Bacteroides spp., Prevotella copri, Alistipes shahii在ACVD患者中豐度更低。

除了組間菌群豐度差異，組間MLG網絡結構也有差異（圖2）。

l ACVD富集的厭氧生物 Streptococcus spp與ACVD減少的Bacteroides spp.呈負相關。

l 同時Streptococcus spp.與ACVD富集的Enterobacteriaceae呈正相關。

l ACVD富集的Eggerthella spp., R. gnavus, Clostridium spp.,Erysipelotrichaceae bacterium, Lachnospiraceae bacterium與ACVD減少的產丁酸細菌Eubacterium eligens, F.prausnitzii, Clostridiales sp. SS3/4呈負相關。

 

圖2. ACVD患者和對照者中組間有顯著差異(q-value <0.05)的MLG（(>100 genes)）關系網絡圖。紅色節(jié)點代表ACVD中富集；青色節(jié)點代表對照者富集。節(jié)點的大小表示該MLG的基因數(shù)量。線的粗細用Spearman相關系數(shù)值代表：粗線, |cc|>0.7; 中度線, 0.5<|cc|<0.7; 細線, 0.3<|cc|<0.5。綠線，正相關；紅線，負相關。

3、 腸道微生物和臨床特征之間的聯(lián)系

使用得到的MLG構建了一個隨機森林分類器（圖3）。ACVD患者的AUC值為0.86，這個數(shù)字要高于使用TMA裂解酶(CutC/D and YeaW/X)（圖3）得到的AUC值(0.63)，這表明除了TMAO還有其它因素影響ACVD。以前研究發(fā)現(xiàn)ACVD富集編碼膽堿-TMA裂解酶（CUTC）的細菌，如Erysipelotrichaceae bacterium, C. nexile和S. anginosus（圖2）。除了TMA裂解酶，一些毒力因子在這些細菌中也可能發(fā)揮作用，如免疫原性脂蛋白A IlpA, PhoP，

phoQ / PhoP雙組分系統(tǒng)，可以部分被宿主抗菌肽誘導。

 

圖3.基于腸道微生物建立的疾病診斷模型?；?/span>405份樣本MLG構建的隨機森林分類器的ROC曲線（紅色）。括號內表示95%的置信區(qū)間。藍線表示基于TMA裂解酶(CutC/D, YeaW/X)構建的ROC曲線。

除了區(qū)分健康認和ACVD患者，MLG與一系列臨床指標相關（圖4）。

l ACVD患者富集的K. oxytoca與血清AST（急性心肌梗死標志物）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）、肌酸激酶同工酶（CKMB）正相關。

l Klebsiela pneumoniae，Bifidobacterum dentium與HBDH正相關。

l ACVD富集細菌包括Streptococcus sp. C300, Streptococcus sp. oral taxon 07173H25Ap, S. salivarius, Oribacterium sinus, Clostridium perfringens與舒張壓或收縮壓呈正相關。

l ACVD減少的F. cf. prausnitzii與血清中尿酸含量負相關，據(jù)報道飲食過多紅肉后血清中尿酸含量增加，而進行DASH 飲食（停止高血壓的一種膳食方法）會降低血清中尿酸含量。

l Clostridium hathewayi與總膽紅素TBIL相關。

 

圖4. ACVD患者富集或減少的MLG與臨床指標相關性。ACVD富集的MLGs用紅圈表示，對照組富集的MLGs用青色圓圈代表。每個圓圈的大小表示這個MLG包含的基因數(shù)。線的粗細用Spearman相關系數(shù)值代表。綠線，正相關；紅線，負相關；灰色虛線表示對照組樣本MLG之間的相關性。

4、 藥物對腸道菌群的影響

PERMANOVA分析表明磺達肝癸鈉、糖尿病藥物阿卡波糖、β-腎上腺素受體阻滯劑美托洛爾對腸道微生物基因豐度的顯著影響，而阿托伐他?。⑵胀祝?/span>對腸道微生物基因豐度有相對程度的影響。使用隨機森林方法能將ACVD患者（用藥或未用藥）與對照組分開，并且AUC較高（圖5A）。當兩種藥物一起分析而不是單個藥物分析時，區(qū)分ACVD患者（未用藥）與對照組的AUC值相對于ACVD患者（用藥）與ACVD患者（未用藥）的AUC更高，而區(qū)分ACVD患者（用藥）與對照組的AUC值相對于ACVD患者（未用藥）與對照組的AUC更低，這意味著如果患者隊列中沒有藥物治療，組間區(qū)別更加明顯，這些結果表明，急性腦血管疾病狀態(tài)，而不是用藥是鑒別患者群體的主要特征。

此外，本文使用MaAsLin調查了藥物使用對腸道菌群特定成員的潛在影響：3個MLG與美托洛爾使用呈正相關，2個MLG與阿托伐他汀使用呈正相關。另外，藥物使用并未使ACVD相關菌株或菌種復雜化。

 

 

圖5. ACVD患者用藥處理隨機森林表現(xiàn)。A. 使用隨機森林方法能將ACVD患者（用藥或未用藥）與對照組分開。B. ROC曲線的AUC和約登指數(shù)。

5、 ACVD患者腸道菌群功能改變

l ACVD患者具有更高單糖和氨基酸運輸水平（磷酸轉移酶系統(tǒng)PTS），而維生素生物合成水平更低（圖6,7）。

l ACVD患者具有降低的四氫葉酸合成能力，因此影響同型半胱氨酸代謝（葉酸由于參與同型半胱氨酸代謝導致其在心血管疾病中起作用）。

l ACVD患者多糖（例如glycosaminoglycans）代謝減弱（圖7）。

l ACVD患者的甘油脂代謝和脂肪酸降解升高（圖7），而抗炎性短鏈脂肪酸（SCFA）降低（圖8）。

l ACVD患者的合成乙酸途徑沒有顯著變化（圖8A），但是TMA裂解酶得到富集（圖8B）。

l ACVD患者的丙酮酸甲酸裂解酶更多，導致會產生更多的甲酸鹽，從而導致高血壓。

l 接著和其他疾病組（CMDs，obesity，T2D，RA）數(shù)據(jù)進行了橫向比較：ACVD患者的MGL Streptococcusspp在肝硬化患者中富集，而Eggerthella并不多。ACVD中富集的E.coli MLGs在其他疾病case-control之間并無差異，說明一些特異或者常見的菌群可以用于診斷ACVD。

 

圖6. ACVD和其他疾病腸道微生物功能模塊的改變。A.PTS傳輸系統(tǒng); B. 氨基酸轉運蛋白; C. 維生素代謝; D. 乳酸生物合成。紅色，患者富集；青色，對照者豐富。

 

圖7. 膜轉運途徑、脂質代謝途徑和宿主糖降解模塊的差異富集。紅色，患者富集；青色，對照者豐富。

 

 

 

 

圖8. ACVD和其他疾病腸道微生物特異功能模塊的改變。A.合成SCFA的酶。B. 合成TMA的酶。紅色，患者富集；青色，對照者豐富。

6、 基于特征微生物的CMDs和肝硬化鑒別。

因為三種CMD（ACVD、糖尿病、肥胖）和肝硬化的腸道微生物功能具有比較高的相似性，因此就想能否找到篩選CMDs/肝硬化的MLGs與功能。在50個確定物種中，包括ACVD富集的MLG，如S. anginosis, S. vestibularis, L. salivarius和ACVD中減少的MLGs，如F. cf. prausnitzii, Bacteroides cellulosilyticus, R.intestinalis用來作為篩選ACVD患者（補充圖9A）。同時，可以基于KO建立LASSO模型用來篩選ACVD患者（補充圖9B），CMDs/肝硬化中排名第一的KO是ACVD中較低的DegS-DegU系統(tǒng)，它可以觸發(fā)生物膜的形成以應對鞭毛的旋轉不暢。ACVD中較低的牛磺酸轉運系統(tǒng)在CMDs/肝硬化模型中也很重要。

CMD與肝硬化菌群特征很相似，那么能否找到區(qū)分每種CMD或者肝硬化的特征微生物呢？

結果發(fā)現(xiàn)Veillonella spp.是鑒別肝硬化的最重要特征菌，B. vulgatus是鑒別二型糖尿病的最重要特征菌，Dorealongicatena是鑒別肥胖的最重要特征菌（補充圖9C）。兩種未分類物種（Acvd-4400 and Acvd-69366）能區(qū)別ACVD與其它兩種CMD。這是首次使用特征菌區(qū)分多種疾病類型。

補充圖9 基于特征微生物的CMDs和肝硬化鑒別。A.篩選CMD患者的重要MLG。紅，ACVD富集；青色，對照組富集；黑色，無顯著性差異。B. 篩選CMD患者的重要KO。C. 篩選每種類型CMD的MLG。

總結：

l 本研究是世界首個大隊列ACVD宏基因組研究，利用MLG構建的診斷模型可以用來對ACVD人群進行診斷；

l ACVD 患者中Enterobacteriaceae和Streptococcus顯著增加，對心血管健康比較重要的幾個分子的代謝或運輸功能也顯著富集。

l 雖然藥物治療是一個混雜因素，但急性腦血管疾病狀態(tài)，而不是用藥才是鑒別患者群體的主要特征。

l 通過比較宏基因組數(shù)據(jù)找到區(qū)別3種CMD和肝硬化的特征菌。