Microbiome：胰腺囊腫液具有獨(dú)特的微生物云

發(fā)稿時(shí)間：2017-11-14來源：天昊生物

副標(biāo)題：胰腺囊腫液具有獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)

英文題目： Pancreatic cyst fluid harbors a unique microbiome

中文題目：胰腺囊腫液具有獨(dú)特的微生物

期刊名：Microbiome            發(fā)表時(shí)間： 2017.11           影響因子：  8.496

發(fā)表單位：荷蘭伊拉茲馬斯大學(xué)鹿特丹醫(yī)學(xué)中心胃腸病學(xué)和肝病學(xué)系

研究對(duì)象：在進(jìn)行超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢（EUS-FNA）時(shí)收集 69疑似囊性病變患者的胰腺囊腫液（PCF）：1）27例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀腺瘤(IPMN)患者：2例主分支型IPMN患者；4例彌漫型IPMN患者；12例單病灶側(cè)分支IPMN患者；4例多病灶側(cè)分支IPMN患者；5例未確定類型IPMN患者；2）13例粘液性囊性腫瘤（MCN）患者；3）9例胰腺假性囊腫患者；4）9例漿液性囊腺瘤（SCA）患者；5）11例具有明顯多種形式的囊性病變，胃腸間質(zhì)瘤（GIST），神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NET），或沒有明確的臨床診斷，這11例患者定義為其它。胰腺囊腫液存儲(chǔ)在?150°C。

表1胰腺囊腫患者的臨床及病理特點(diǎn)

DNA提取試劑盒：300 μl的胰腺囊腫液用于DNA提取，試劑盒為Wizard DNA isolation kit (catalog no. A1620, Promega BNL B.V)

技術(shù)手段：16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序（V3-V4）

研究背景： 很明顯，特定的腸道細(xì)菌參與胃腸道不同癌前病變的發(fā)展。然而對(duì)胰腺囊性病變微生物成分的分析尚未完成。這就促使我們探討內(nèi)鏡下獲得的胰腺囊腫液體（PCF）是否含有細(xì)菌，并確定該材料中存在的細(xì)菌屬。

研究結(jié)果：

1、 細(xì)菌DNA存在于EUS-FNA收集的胰腺囊腫液中

目前尚不清楚胰腺囊液是否有微生物成分，通過16S rRNA PCR分析發(fā)現(xiàn)69例胰腺囊腫液樣本中有64例存在細(xì)菌DNA（表2）。囊腫液中細(xì)菌DNA的存在與病變類型無顯著關(guān)聯(lián)：在粘液性囊性腫瘤（MCN）患者中，100%樣品含有大量細(xì)菌DNA；在IPMN樣本，92.6%樣品含有大量細(xì)菌DNA；在假性囊腫和漿液性囊腺瘤，88.9%樣品含有大量細(xì)菌DNA；在其它組，90.9%樣品含有大量細(xì)菌DNA。

表2使用PCR，Sanger測(cè)序和NGS確定胰腺囊腫液中的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)特點(diǎn)

2、 不同臨床類型胰腺囊腫液的微生物組成

16S rRNA通用引物PCR產(chǎn)物的Sanger測(cè)序結(jié)果顯示69個(gè)樣品中有13個(gè)樣品存在Fusobacterium spp.（梭菌屬）。PCF中另一個(gè)主要細(xì)菌是Bacillus spp.（芽孢桿菌），69個(gè)樣品中有16個(gè)樣品都存在這個(gè)菌。另外還檢測(cè)到的細(xì)菌包括：Ruminococcus spp., Staphylococcus spp., Caldimonas spp., Arthrobacter spp., Acinetobacter spp., Bacteroides spp., Orpinomycesspp., Anaerococcus spp.（表2）。

為了確認(rèn)這些細(xì)菌存在和深入了解PCF中的細(xì)菌組成，16S rRNA基因拷貝數(shù)最高的23個(gè)PCF樣品進(jìn)行了16S rRNA （V3-V4） 擴(kuò)增子測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：豐度最高的菌屬分別是：Bacteroides（類桿菌屬）, Escherichia（埃希氏菌屬）/Shigella（志賀氏菌屬）,  Acidaminococcus（氨基酸球菌屬）（圖2）。不同類型的囊腫在微生物組成上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外不同組別的多樣性指數(shù)也相似（圖3）。

圖2. 33個(gè)胰腺囊腫液體樣品微生物屬的分類組成。a 漿液性囊腺瘤（SCA）微生物組成; b胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀腺瘤(IPMN)微生物組成；C胰腺假性囊腫微生物組成；d粘液性囊性腫瘤（MCN）微生物組成;

圖2. 胰腺囊腫液體樣品的微生物多樣性香農(nóng)指數(shù)。

3、 囊腫類型和切除術(shù)后的多樣性

不同類型囊腫之間、切除組與非切除組之間、癌胚抗原（CEA）和癌抗原19.9（CA19.9）之間微生物多樣性指數(shù)也相似。這個(gè)結(jié)果與不同類型囊腫16S rRNA通用引物PCR產(chǎn)物的Sanger測(cè)序結(jié)果一致。

4、 胰腺囊腫液微生物組成表明其是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)

將PCF細(xì)菌組成和人類微生物組計(jì)劃（HMP）13個(gè)不同身體部位微生物組成進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：與糞便比較時(shí)，PCF具有26種獨(dú)特的細(xì)菌基因型；與喉道比較時(shí)，PCF具有27種獨(dú)特的細(xì)菌基因型；與舌背比較時(shí)，PCF具有28種獨(dú)特的細(xì)菌基因型；另外PCF中有36種獨(dú)特的細(xì)菌基因型不存在于任何其它身體部位（圖4）。

圖4. 胰腺囊腫具有一個(gè)與其它人體不同的獨(dú)特微生物組成。與其它身體部位相比，使用二項(xiàng)式檢驗(yàn)和ANOVA 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCF中存在27-314種差異細(xì)菌基因型。

ANOVA分析（確定細(xì)菌種群的影響大小）發(fā)現(xiàn)：將PCF細(xì)菌組成和HMP不同身體部位細(xì)菌組成進(jìn)行比較時(shí)有314細(xì)菌菌群具有影響大小的變化，高影響菌種如圖5所示，這個(gè)結(jié)果說明PCF含有獨(dú)特的微生物組成，但是唯一性不能歸咎于某個(gè)單一的菌屬。

圖5. 單個(gè)菌屬對(duì)PCF獨(dú)特性的貢獻(xiàn)。相對(duì)于其他13個(gè)身體部位，PCF中的82個(gè)豐度差異菌屬以及對(duì)PCF獨(dú)特性的相對(duì)貢獻(xiàn)。

相對(duì)于其他13個(gè)身體部位，PCF中存在相對(duì)高豐度和低豐度的特異菌種：PCF中有17種豐度較高的特異菌種，如擬桿菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬、普氏菌屬、氨基酸球菌屬屬、鞘氨醇單胞菌屬、雙歧桿菌屬等，這些細(xì)菌被證明在結(jié)腸、肺和肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用。另外有15種細(xì)菌菌屬在13個(gè)身體部位豐度較高：鏈球菌屬、丙酸桿菌屬、乳酸桿菌、梭桿菌屬、棒狀桿菌屬、韋榮氏球菌屬、奈瑟菌屬、葡萄球菌屬等，這些菌同時(shí)也是PCF中存在最少的細(xì)菌。這個(gè)比較說明PCF中定植的細(xì)菌是獨(dú)一無二的，PCF存在的高豐度菌屬具有在癌微環(huán)境中繁殖和喂食腫瘤的傾向（圖6）。

圖6. 相對(duì)于其他13個(gè)身體部位，PCF中存在相對(duì)高豐度和低豐度的特異菌種

結(jié)論：

•  觀察到常規(guī)PCR的檢出率為98.2%，而使用NGS的胰腺囊液（PCF）細(xì)菌檢出率則高達(dá)100%。
•  相對(duì)于其他13個(gè)身體部位，PCF中有17種豐度較高的特異菌種，如擬桿菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬、氨基酸球菌屬屬等菌屬。
•  這些結(jié)果揭示了胰腺囊液中存在一個(gè)明顯特異的細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)。這其中包括一些具有潛在有害功能的細(xì)菌類群，這表明在這一生態(tài)位的獨(dú)特微生物有可能促進(jìn)胰腺腫瘤進(jìn)程。