高通量連接探針擴增技術在第八屆國際先心病高峰論壇上閃亮登場

發(fā)稿時間：2017-11-15來源：天昊診斷

         2017年10月10-12日，國際先天性心臟病高峰論壇暨中國胎兒心臟出生缺陷一體化診療協(xié)作組2017年年會在上海盛大召開。

         本次會議對先天性心臟病的診治前沿、外科術式及遠期療效、內外科綜合診療以及圍術期管理等方面進行深入的探討。會議邀請國際小兒先天性心臟病外科協(xié)會主席、美國國立兒童醫(yī)學中心心臟中心主任Richard Jonas擔任會議的共同執(zhí)行主席，同時邀請包括中國、日本、韓國、歐美、澳大利亞在內的國際嘉賓同行進行專題講座和現(xiàn)場交流，并一起分享交流今年國內外兒童心血管學科的最新進展及共同的機遇和挑戰(zhàn)。

         本次會議上，天昊基因科技（蘇州）有限公司的CEO姜正文博士帶來的《高通量連接探針擴增技術在胎兒心臟出生缺陷遺傳診斷中的應用》 精彩學術報告在會場上引起強烈反響。

         復旦大學遺傳學和遺傳工程系本科生及碩士生，于2008年3月獲美國辛辛那提大學環(huán)境基因組學專業(yè)博士，是蘇州工業(yè)園區(qū)第五屆科技領軍人才、2014年江蘇省高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才獲得者，是復旦大學副校長金力院士的碩士及博士研究生，先后工作于國家人類基因組南方研究中心以及中科院計算生物學研究所，發(fā)表二十多篇SCI論文，是公司所有技術平臺的主要開發(fā)者以及所有創(chuàng)新技術的發(fā)明者。

         高通量基因拷貝數(shù)檢測技術（HLPA）是天昊診斷自主創(chuàng)新的專利技術，該技術是基于熒光毛細管電泳平臺，設計靶向探針進行拷貝數(shù)計算，通過與參照樣本的拷貝數(shù)對比，確定靶向染色體片段拷貝數(shù)是否正常，以此達到檢測拷貝數(shù)的目的。



1. 先心病患兒的高出生率：

         心臟缺陷是最普遍的出生缺陷。在2015年，全國的心臟缺陷患者是4890萬，根據(jù)診斷方式的不同，心臟缺陷患兒的出生率大約是每1000個活產(chǎn)嬰兒就有4-75個患兒。

         在中國，先天性心臟病每年影響著18萬-22萬的孩子。

2. 導致先天性心臟病的原因：

         非遺傳性的：
         環(huán)境致畸
         母源性因素
         感染因素

         遺傳性的：
         染色體非整倍體
         染色體微缺失微重復
         單基因疾病

3. 根據(jù)先心病患兒發(fā)病部位的統(tǒng)計：

         心臟缺陷的位置通常在患者的嬰兒期就能被確認，流行的程度是基于CONCOR數(shù)據(jù)庫來估計的。下面的數(shù)據(jù)是每百萬活產(chǎn)嬰兒中根據(jù)心臟缺陷的位置來統(tǒng)計的患兒的數(shù)量。

4. 由染色體結構異常導致的綜合征型先心病

         染色體結構異?？蓪е戮C合征型先心病的發(fā)生，最為常見的是22q11的缺失，缺失部位發(fā)生在22q11.2上，大多數(shù)22q11.2缺失綜合征是每個細胞的一條22號染色體上有一個3Mb堿基對的缺失，這段缺失大約涉及30-40個基因。其中位于22q11.2上的TBX1可能導致22q11.2微缺失綜合征的大多數(shù)臨床特征。最主要的臨床癥狀是先天性心臟?。?0-100%的患者），尤其是先天性心臟錐干畸形（法洛四聯(lián)癥、主動脈弓中斷、室間隔缺損及動脈干），其他的癥狀包括上顎畸形（69%）、學習障礙（70-90%）、免疫缺陷、低鈣血癥、腎臟異常、聽力喪失和喉氣管食管異常等。22q11.2微缺失綜合征大多都是新發(fā)突變導致的（約占90%），約10%患者的缺失遺傳于父母。除了22q11缺失外，其他包括Williams-Beuren、Cri-Du-Chat、Cat-Eye、Jacobsen等綜合征都能引起先心病。

5. 與拷貝數(shù)變異相關的復發(fā)性非綜合征型先心病

         大多數(shù)的非綜合征型先心病是由多基因控制的，即：絕大部分非綜合征型先心病是由于多個基因座上存在有易感基因并共同相互作用，有時還需要一定的環(huán)境因素參與而導致的。如1q21.1這個位置上的缺失會造成法洛氏四聯(lián)癥、主動脈瓣狹窄、心室中隔缺損等。而在這個基因座上能引起先心病的基因卻有好多個。

6. 由單基因遺傳病引起的先心病

         通常這種類型的先心病患兒父母一方也是患有先心病的，或是父母雙方?jīng)]有先心病但都同時帶有同一先心病基因的突變，當患兒同時攜帶有父母這對等位基因的突變時就有可能致病。

7. 拷貝數(shù)異常的篩查對于鑒別遺傳因素引起的先心病患者的重要性

         在用CMA（染色體微陣列）技術對先心病患者檢測后，對遺傳因素引起的先心病進行統(tǒng)計：

         ? 對514名先心病患者用CMA進行檢測，總體檢出率為12.8 (致病的拷貝數(shù)變異）-18.5% （致病的和可能致病的拷貝數(shù)變異）

         ? 綜合征型先心病的診斷率為14.1-20.6%（不包括染色體非整倍體的病例）

         ? 單獨的先心病的診斷率為4.3-9.3%

        研究發(fā)現(xiàn)，由于患者染色體拷貝數(shù)變異引起的先心病具有很大的一部分比例，而染色體拷貝數(shù)變異又是引起染色體微缺失/微重復綜合癥的主要原因。因此，對先心病患者進行分類就顯得尤為重要。

8. 幾種拷貝數(shù)變異檢測方法進行比較：

         ? CGH（比較基因組雜交）：整個基因組進行檢測，分辨率低（0.5-1Mb）

         ? CMA (染色體微陣列）：整個基因組進行檢測，分辨率高（~100Kb）

         ? NGS （二代測序）：整個基因組進行檢測，分辨率依賴于檢測的深度（100Kb-5Mb）

         ? 目標拷貝數(shù)變異檢測(MLPA, CNVplex): 對目標區(qū)域進行檢測，高分辨率（<1Kb)

          目標拷貝數(shù)變異檢測無論在分辨率、檢測成本還是實驗操作的難易程度上都具有明顯優(yōu)勢。

9. 新一代MLPA, CNVplex?高通量連接探針擴增技術（HLPA)

          采用連接酶高特異性連接反應對目的區(qū)域進行雜交、連接，通過專利技術在連接探針末段引入不同長度的標簽序列獲得長度各異的目的探針連接產(chǎn)物，利用熒光標記的通用引物對連接產(chǎn)物進行PCR擴增，通過熒光毛細管電泳對擴增產(chǎn)物進行電泳分離檢測，最后通過對電泳圖譜的分析獲取各個位點的峰高，進而對樣品目的區(qū)域的拷貝數(shù)進行分析。

          高通量：雙連接后進行多重熒光PCR
          高檢出率：一個反應超過200個探針
          高準確性：小探針的高效連接，變異系數(shù)低（CV<10%)

10. 采用天昊基因自主專利CNVplex?技術對273例先心病患者進行檢測，遺傳學病因的檢出率為~10%，這與文獻報道的先心病患者可診斷的遺傳學病因的概率12.8%基本一致。

          根據(jù)姜博士在會場上分享的數(shù)據(jù)，先心病患者中約有10%的患者同時帶有染色體微缺失微重復（拷貝數(shù)異常），而部分微缺失/微重復是導致患兒死亡的病因。染色體微缺失/微重復的先心病患兒通常會有特殊面容及不同程度的先天畸形，他們的內分泌代謝也會有異常（血鈣降低、甲狀旁腺素降低等）影響患兒生長發(fā)育，患兒也容易出現(xiàn)免疫功能異常、精神運動發(fā)育遲緩、學習困難、智力障礙等情況。因此，染色體微缺失/微重復檢測對診斷和治療先心病具有重要的現(xiàn)實意義。

          1. 排查染色體是否存在異常，并明確異常來源，確定病因。

          2. 如果發(fā)現(xiàn)有微缺失患兒，該夫婦再次生育患病兒的風險增大，有利于為有計劃生育下一胎的家庭提供必要的醫(yī)學遺傳學指導。

          3. 能使醫(yī)生及時給出治療方案，減緩病情，治療病癥，改善患兒生存質量。

          4. 降低圍產(chǎn)兒病死率，降低出生缺陷率，提高人口素質。



          本項檢測所采用的技術是在傳統(tǒng)的多重連接探針擴增技術（MLPA）基礎上經(jīng)公司自主研發(fā)改進后具有自主知識產(chǎn)權的CNVplex?高通量連接探針擴增技術（HLPA），詳細技術原理說明見附錄四。該檢測體系由8個CNVplex反應組成，總共包含了1428對探針，覆蓋了200個核心區(qū)域以及核心區(qū)域兩側一定范圍區(qū)域、所有染色體著絲粒兩側和兩端染色體離末端約0Mb, 10Mb, 20Mb處區(qū)域、以及3個突變位點（RBM8A ：c.67+32G>C, c.-21delG; FGFR3：c.1138G>A），可對DECIPHER認定的70個綜合征對應區(qū)域缺失重復或點突變位點(見下圖)，ISCA數(shù)據(jù)庫中所有被至少4個先天系統(tǒng)性發(fā)育異常以及智力發(fā)育遲緩高風險CNV區(qū)段覆蓋的區(qū)域的缺失重復，以及所有染色體非整倍體及染色體末端缺失重復進行檢測，預計對致病高風險的染色體微缺失微重復突變的檢出率為90%以上。


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4. Akl C. Fahed, MD et al., Genetics of Congenital Heart Disease: The Glass Half Empty Circ Res. 2013 February 15; 112(4):
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