天昊客戶新文：微生物參與淡水生境中植物凋落物分解

發(fā)稿時間：2018-01-12來源：天昊生物

  

中國科學院地理與湖泊研究所近期在《FEMS Microbiology Ecology》上發(fā)表了微生物參與淡水生境中植物凋落物分解的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的擴增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Microbes participated in macrophyte leaf litters decomposition in freshwater habitat

中文題目：微生物參與淡水生境中植物凋落物分解

期刊名：FEMS Microbiology Ecology      

發(fā)表時間： 2017年    

影響因子：3.72

研究目的

關于淡水湖泊植物凋落物分解過程中涉及的水生微生物的知識仍然很少，本文使用原位試驗（150天）對三種水生植物（茭白、黑藻、杏菜）凋落物分解過程及其相關微生物進行研究從而回答以下3個問題：

1）  哪些類型的細菌和真菌參與植物凋落物在表層沉積物的分解？

2）  調節(jié)植物凋落物分解過程中的細菌和真菌群落組成的主導因子是什么？

3）  微生物分解過程中細菌和真菌之間的主要關系是什么？

     研究對象

     水生植物茭白（Zl）、黑藻（Hv）、杏菜（Np）新鮮葉片從東太湖灣收集。樣品儲存在無菌塑料袋，放置在冰上并在24小時內并運到實驗室。葉片組織用去離子水輕輕沖洗去除表面雜質，然后300×g室溫離心10 min 除去水份。使用消毒刀將預處理的組織被切成2-5厘米，每片落葉的15克放置在一個5mm的玻璃纖維網格袋中。將袋子用石塊綁在漁網上，然后在2-3米深的沉積物表面懸掛，所有的漁網都系上了繩子，緊緊地綁在岸上。然后在第0、5、10、20、30、60、90、150、210、270和330天進行取樣，每個時間點取4個生物學重復。整個實驗在150天后停止，每個物種的網袋分別合并然后進行后續(xù)分析。另外收集500毫升環(huán)境湖泊水用于化學分析，例如總氮含量（TN）、總磷（TP）和總有機碳（TOC）。

植物凋落物組成和水解酶活性測定：

5 g預分離組織凍干并磨成均勻的細粉末，測定凍干組織的碳含量（c）、氮含量（n %）、磷含量（P %）、纖維素含量、半纖維素含量、木質素含量。

離心后，1 g植物凋落物和9毫升PBS緩沖液混合,并在冰上孵育15分鐘，勻漿1510 g離心20 min，上清液用于測定纖維素酶、木聚糖酶、多酚氧化酶和過氧化物酶活性。

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附生微生物通過30秒震顫（10 × g）和5分鐘超聲波處理從植物組織脫離下來。使用0.2μm孔徑的聚碳酸酯過濾器(Millipore, USA)收集含有附生微生物的懸浮液。該過濾器存儲在–80度直到進一步的核酸提取。該過濾器被切成小塊，使用E.Z.N.A water DNA kit D552501 (Omega BioTek, Norcross, GA, USA)提取基因組DNA。

測序技術：細菌16S rRNA擴增子測序（V4）和真菌18S rRNA擴增子測序（V9）

數據庫：16S rRNA（RDP數據庫）；18S rRNA（SILVA數據庫）

研究結果：

不同植物凋落物的分解率、材料組成和酶活性

◆ 網袋中黑藻（Hv）和杏菜（Np）超過98%的生物量在90天后消失，而茭白（Zl）超過64%的生物量在150天后消失（圖1a）。

◆ 基于指數衰減模型（生物質損失轉化為分解速率, 用k值表示），不同植物變化明顯不同（圖1b）。在早期階段k值的順序是kZl < kHv < kNp，在后期，kHv值高于kNp。KZl最初先增強后下降，kHv和kNp均表現為持續(xù)下降趨勢。

圖1 三種植物凋落物在150天試驗中的剩余生物量（a）和分解速率（b）

◆ 碳和氮含量隨著降解過程逐漸減少（圖2）。Hv和Np的磷含量隨著降解過程逐漸減少，Zl相對比較平穩(wěn)。

◆ Np的C/N比在降解的初始階段增加，Hv和Zl則是先上升后回落。

◆ 在實驗開始時，纖維素和木質素含量在Zl中最高，在Np中最低，半纖維素含量在Hv最高。Zl和Np的纖維素和半纖維素含量隨著分解進程逐漸增加而Hv則是下降。隨著時間的推移所有三種植物的木質素含量略有變化，最低值出現在第20天。

◆ 纖維素酶活性在Zl中隨著分解進程顯著增加，然而，Hv的纖維素酶活性在頭幾天則受到明顯抑制。木聚糖酶活性在Np樣品中弱增強。多酚氧化酶活性只在Zl和Np樣本中啟動。過氧化物酶活性在Np樣本中顯著增強，但變化幅度較大。

 

圖2 植物凋落物在分解進程中的養(yǎng)分含量、物質組成和酶活性

在分解過程中的細菌和真菌群落組成

◆ 細菌α多樣性隨著降解時間顯著增加，三種植物的細菌α多樣性變化也不同（圖3）：Zl和Np的α多樣性指數（Shannon–Wiener 和Faith’s PD）隨時間增加而增加，而Hv的α多樣性指數增加至30天，然后下降。Pielou’s 指數增加了30天，然后在接下來的時間內保持穩(wěn)定，表明細菌群落的均勻度隨著分解過程而增加。

◆ 真菌α多樣性隨著降解時間而增加（圖3）：Hv樣本的真菌OTUs豐度和Faith’s PD隨時間增加而增加，在第30天達到最高峰，Zl和Np 樣本則是在10天略有下降，然后增加到實驗結束。Zl和Np樣本的Shannon–Wiener和 Pielou’s指數分別在第5和2天出現最低值，Hv樣本則是先升后降，然后再上升。

 

圖3 三種水生植物分解過程中細菌和真菌群落的α多樣性指數

 ◆細菌優(yōu)勢菌是厚壁菌門，β-變形菌綱，γ-變形菌綱，擬桿菌門，藍細菌，δ-變形菌綱和α-變形菌綱（圖4a）。γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）在所有樣品的初始階段豐度最高，然后逐漸減少，而厚壁菌門（Firmicutes）, β-變形菌綱（Betaproteobacteria）, δ-變形菌綱

 

圖4（A） 植物凋落物分解過程中的優(yōu)勢細菌門及其貢獻

◆ 真菌優(yōu)勢門是Cryptomycota（隱真菌門），Chytridiomycota（壺菌門），Basidiomycota（擔子菌門）。在降解初期，Zl 和Hv樣本豐度最高的是 Basidiomycota（圖4b）。Chytridiomycota在Np樣本的初始階段豐度最高。Cryptomycota的相對豐度在分解過程中顯著增加，其在Np，Hv和Zl樣本中的最高值分別出現在第20, 30天和150天。

 

圖4（B） 植物凋落物分解過程中的優(yōu)勢真菌門及其貢獻

◆ 從5541個OTUs中選擇了18個common bacterial OTUs（圖5a）, 在這18個OTUs中有7個OTUs相對均勻分布在三個植物中，兩個屬于Bacteroidetes的OTUs在Zl樣品中更豐富，OTU4227b（屬于Cyanobacteria）是Np樣本特異擁有的。Specific bacterial OTUs則在三個植物中分布不均勻（除了OTU637b）（圖5b），Zl樣本有8個Specific bacterial OTUs，Hv樣本有3個，Nv樣本沒有任何Specific bacterial OTUs。

◆ 從614個 OTUs中選擇了18個common fungal OTUs（圖5c），屬于Chytridiomycota和Cryptomycota。4個OTUs在Hv樣本中富集，特別是OTU610f。 屬于Chytridiomycetes的OTU428f在是Np樣本中富集。屬于Basidiomycota的2個OTUs在Zl樣本中富集。19個specific fungal OTUs中大部分只在某種植物中存在（除了OTU113f 和OTU77f）（圖5d）。屬于Opisthokonta的OTU595f只在Hv樣本中存在，屬于Basidiomycota的2個OTUs和屬于Opisthokonta的2個OTUs只在Zl樣本中存在，7個大部分屬于Chytridiomycota的OTUs只在Np樣本中存在。

 

圖5 植物凋落物分解過程中的common 和specific細菌OTUs（A和B）以及真菌OTUs（C和D）

微生物群落與凋落物特征以及環(huán)境因素的關系

◆ RDA分析發(fā)現環(huán)境水體中的總磷（TP）和剩余凋落物的C%與細菌和真菌群落組成顯著相關（表1和圖6）。凋落物的C/N比和纖維素酶（cellulase）活性只與細菌群落組成有顯著相關性。在分解過程中，環(huán)境水體中的總氮（TN）、N%、P%、 N/P、木聚糖酶（xylanase）活性與真菌群落組成呈顯著相關。

表1  水環(huán)境因子和植物特征與細菌和真菌群落組成的線性回歸分析

◆ 從RDA二維圖可以看出，整個降解過程可以分為三個階段：初期（0天）、中期（5-30天）和后期（60-90天）（圖6a和b）。影響微生物群落動態(tài)的因素也各不相同：在初始階段，水體總磷（TP）對微生物群落組成有顯著影響; 在中期，凋落物的C%和C/N比對細菌有影響，而N/P和木聚糖酶（xylanase）活性與真菌群落有一定的相關性。在后期，纖維素酶（cellulase）活性與細菌群落動態(tài)明顯同步。

 

圖6  使用RDA揭示環(huán)境和生理因素與細菌（A）和真菌（B）群落組成的相關性

 

研究結論

1.杏菜（Np）凋落物分解是最快的，而茭白（Zl）凋落物分解是最慢的。

2.細菌群落和真菌群落的α多樣性顯著增加，群落結構隨著時間推移表現出明顯的變化。

3.對于細菌，γ-變形桿菌的相對豐度下降，而厚壁菌門, β-變形菌綱, δ-變形菌綱和α-變形菌綱增加。在所有三種植物中，真菌的優(yōu)勢物種Cryptomycota（隱真菌門）顯著增加。

4.細菌和真菌與水中總磷量以及凋落物中碳含量顯著相關。

5.凋落物中氮含量、磷含量和N/P的動態(tài)變化對真菌群落的影響大于對細菌群落的影響。而纖維素酶和木聚糖酶活性與細菌和真菌群落有顯著的相關性，從而了反映細菌和真菌在凋落物分解中的生態(tài)位分化和協(xié)同作用。