腫瘤組織和cfDNA外顯子組捕獲測序 標準服務說明

發(fā)稿時間：2018-05-09來源：天昊生物

1. 服務介紹

腫瘤因體細胞突變（Somatic Mutation）積累引起。相較于常規(guī)樣本中生殖突變（Germline Mutation）位點的檢測，腫瘤樣本因為純度低、異質性高、突變頻率低等原因，需要更高的測序深度、更優(yōu)化的數據分析方法才能更有效精確地鑒定其中的突變位點。

全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES），作為大規(guī)模組學研究的常備技術，是一種利用雜交技術將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕獲富集后進行高通量測序，從而鑒定并發(fā)現與蛋白質結構、功能變異相關突變的技術手段。相較于全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS），全外顯子組測序更加經濟、高效，在相同測序成本條件下，可以高深度地檢測更多的實驗樣品，更為精準地鑒定常見變異以及罕見變異，高效發(fā)現全新突變。

天昊生物使用全自動核酸抽提工作站，確保樣本抽提的穩(wěn)定性，最大程度避免樣本間污染；使用業(yè)內最優(yōu)的Covaris超聲基因組片段化方案，結合精心優(yōu)化的文庫構建體系進行DNA文庫構建，最大程度地保證文庫轉化效率，在滿足高深度測序的同時，盡可能減少珍貴實驗樣本的消耗；高口碑的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片，捕獲效率優(yōu)，目標區(qū)域覆蓋均勻度高；多重保障確保腫瘤樣本體細胞突變檢出的靈敏度和特異性。

2. 技術優(yōu)勢

•   金標準：使用業(yè)界公認的Agilent SureSelect Human All Exon V6芯片。
• 一代驗證：免費使用SNPscan?技術確保樣本中高頻突變檢出的準確性。
•  高性價比：相較全基因組測序，相同測序量可高深度地檢測更多實驗樣品。

3. 應用領域

多個癌種的組織或cfDNA全外顯子捕獲測序

4. 技術路線圖

 

5. 技術參數及分析內容

 

6. 案例分析

案例1：EGFR突變的晚期肺癌患者中共現的遺傳變異對進化和臨床的影響

Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers

期刊：Nature Genetics

發(fā)表時間：2017年11月

影響因子：27.959

第一單位：Department of Medicine, University of California, USA

 

背景簡介：關于癌癥遺傳學和治療當前主要關注某一種致癌基因呈陽性的疾病，例如非小細胞肺癌中EGFR突變，但是這種方法并沒有解決癌癥中一些共現的遺傳變異的潛在風險。那么這些共現的遺傳變異究竟能達到怎樣的程度，與主要的驅動基因（如EGFR）共同促進腫瘤發(fā)展和治療抗性？本研究就提出這樣的假設：共現的遺傳變異普遍存在，而且與主要的驅動基因組成共驅動基因（co-drivers），從而促進腫瘤進展并且限制靶向治療的效果。

 

研究方法：收集1122例EGFR突變陽性和1008例突變陰性的晚期肺癌患者的全血樣本，對其中游離的DNA（cfDNA）進行68個臨床相關的基因的外顯子進行測序分析。并且對一例EGFR突變肺癌患者的7份縱向收集的樣本進行全外顯子測序。

 

主要結果：

1.晚期EGFR突變肺癌患者cfDNA分析：首先在EGFR突變陽性和陰性組之間發(fā)現了部分共現的突變基因，而且有顯著差異（圖1）。而且在440例EGFR p.Thr790Met突變陽性和682例突變陰性之間也發(fā)現了差異性的共現變異（圖2）。

2.EGFR突變患者cfDNA與臨床結果：對不同時期的TKI治療患者的cfDNA進行分析發(fā)現了治療能夠誘導基因組共現變異的進化（圖3）。

3.基因組縱向時空的表征分析：伴隨TKI治療和抗性的進展，在診斷期患者超過75%的編碼區(qū)突變呈克隆級別，但在死亡時下降到50%-58%，同時出現了亞克隆的突變（圖4）。

 

研究結論：

本研究強調了開展更多知情的及基因上授權的，包括分子診斷、監(jiān)測及動態(tài)應用多種理性的治療策略的重要性，來處理克隆和亞克隆的共現變異，從而更好地控制癌癥。而且本研究所揭示的內容有助于改變當前關于對癌基因呈陽性肺癌的認識，也為基礎和臨床研究提供了未來的方向。

 

圖1 晚期EGFR突變陽性與陰性肺癌患者間cfDNA共現的基因組變異 

 

圖2 440例EGFRp.Thr790Met突變陽性和682例突變陰性晚期NSCLC患者共現的基因組變異比較

圖3 EGFR突變晚期NSCLC患者cfDNA中檢測到隨治療誘導的基因組共現變異的進化

 

圖4 一例EGFR突變患者從診斷到死亡期間腫瘤及cfDNA縱向基因組分析

 

[1] Blakely CM, Watkins TBK, Wu W, Gini B, Chabon JJ, et al. (2017) Evolution and clinical impact of co-occurring genetic alterations in advanced-stage EGFR-mutant lung cancers. Nat Genet 49: 1693-1704. DOI: 10.1038/ng.3990.

 

案例2：追蹤非小細胞肺癌的進化發(fā)展

Tracking the evolution of non-small cell lung cancer

期刊：The New England Journal of Medicine

發(fā)表時間：2017年6月

影響因子：72.406

第一單位：The Cancer Research UK Lung Cancer Centre of Excellence

 

背景簡介：英國癌癥研究中心（Cancer Research UK）自2014年4月開始資助招募患者,通過治療來追蹤非小細胞肺癌的進化發(fā)展，這是一項多個中心協(xié)調進行的前瞻性群組研究，預期收集842例肺癌患者腫瘤組織樣本進行高深度、多區(qū)域的全外顯子測序，其目的是為了驗證瘤內異質性（突變、拷貝數變異）與臨床轉歸相關這一假設。本文對首先收集的100例患者樣本進行分析。

 

研究方法：利用Illumina Hiseq技術對327個腫瘤區(qū)域（100例患者）及100例對應的全血germline樣本進行全外顯子測序，測序深度達到426×。

 

主要結果：

1.非小細胞肺癌瘤內異質性：30%的體細胞突變（中位數）及48%的拷貝數變異（中位數）分別被識別為亞克隆，表明在腫瘤的發(fā)展中突變和染色體水平上的基因組不穩(wěn)定性過程一直在發(fā)生（圖1A）。另外亞克隆拷貝數變異比例較高的患者其復發(fā)或死亡風險顯著更高（P = 4.4×10^?4，圖1C），而亞克隆突變的比例與腫瘤復發(fā)并無顯著的相關性（P = 0.70，圖1B）。

2.非小細胞肺癌瘤內異質性的影響因素包括突變過程、染色體不穩(wěn)定性及基因組加倍。

3.克隆或亞克隆驅動基因的改變與基因組事件的發(fā)生時間：特定癌癥的基因改變主要是在克隆水平，而且在基因組復制前就會發(fā)生，這表明這些改變參與了癌癥的起始（圖2）。以腺癌為例，這些改變包括EGFR/MET/BRAF靶向的突變或擴增，TERT基因8p缺失及5p增加等。

 

研究結論：

通過對早期非小細胞肺癌驅動事件與克隆性之間的關系進行研究，能夠發(fā)現基因組不穩(wěn)定性不僅是平行進化的重要驅動因素，而且預示了較差的預后。

 

 

圖1 非小細胞肺癌患者腫瘤組織的基因組異質性

 

圖2 體細胞事件在非小細胞肺癌進化中的時間進程

 

[2] Jamal-Hanjani M, Wilson GA, McGranahan N, Birkbak NJ, Watkins TBK, et al. (2017) Tracking the Evolution of Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med 376: 2109-2121. DOI: 10.1056/NEJMoa1616288.