【昊文章】天昊基因與浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院合作發(fā)現(xiàn)SAMD12基因內(nèi)含子區(qū)五核苷酸（TTTCA）重復(fù)插入導(dǎo)致家族性皮層肌陣攣性震顫癲癇1型

發(fā)稿時(shí)間：2018-07-03來源：天昊生物

天昊基因科技（蘇州）有限公司與浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（浙醫(yī)二院）神經(jīng)內(nèi)科羅巍教授合作研究成果 “Intronic pentanucleotide TTTCA repeat insertion in the SAMD12 gene causes familial cortical myoclonic tremor with epilepsy type 1” 于2018年6月23日在線發(fā)表于國際臨床神經(jīng)病學(xué)及神經(jīng)科學(xué)頂級期刊《Brain》，首次報(bào)道中國人群SAMD12基因內(nèi)含子區(qū)五核苷酸（TTTCA）重復(fù)插入導(dǎo)致家族性皮層肌陣攣性震顫癲癇1型。浙醫(yī)二院神經(jīng)內(nèi)科岑志棟博士和公司總經(jīng)理姜正文博士為共同第一作者，全資子公司上海天昊生物科技有限公司遺傳分析中心生物信息部經(jīng)理李才華博士，研發(fā)部經(jīng)理王滔博士，蘇州天昊醫(yī)藥研發(fā)中心技術(shù)部經(jīng)理余鋒也作為文章的作者分享了這一成果。

天昊生物在該研究中參與了家系樣本的外顯子測序、全基因組測序和生信分析工作，在恭喜天昊生物客戶發(fā)表重磅文章的同時(shí)，我們想第一時(shí)間和大家分享一下這篇文章的研究思路。

 

英文題目：Intronic pentanucleotide TTTCA repeat insertion in the SAMD12 gene causes familial cortical myoclonic tremor with epilepsy type 1

中文題目：SAMD12基因內(nèi)含子區(qū)五核苷酸（TTTCA）重復(fù)插入導(dǎo)致家族性皮層肌陣攣性震顫癲癇1型

期刊名：《Brain》    

發(fā)表時(shí)間： 2018年6月23日    

影響因子：10.84

研究背景

• 家族性皮質(zhì)肌陣攣性震顫癲癇（familial cortical myoclonic tremor with epilepsy, FCMTE）是一種成年起病，以皮質(zhì)震顫和癲癇發(fā)作為核心癥狀的高外顯率常染色體顯性遺傳病。
•  該疾病表現(xiàn)典型的遺傳異質(zhì)性，根據(jù)致病區(qū)域連鎖定位可分為4種亞型: FCMTE1 (8q24, OMIM: 601068); FCMTE2 (2p11.1-q12.2, OMIM: 607876); FCMTE3 (5p15.31-p15.1, OMIM: 613608)和FCMTE4 (3q26.32–3q28, OMIM: 615127)。尚無肯定致病基因的報(bào)道。
• FCMTE1亞型僅在中國和日本有報(bào)道，本研究目的在于確定中國FCMTE1家系的致病基因。

 

研究方法

•  臨床樣本：20個(gè)FCMTE家系；
• 研究手段：

■ 連鎖分析和單倍型分析（5個(gè)家系進(jìn)行基因組SNP芯片分型檢測；6個(gè)家系進(jìn)行chr8: 104 863 833–134 036 685區(qū)域內(nèi)STR分型）；

■ 選取先證者全外顯子測序，沒有發(fā)現(xiàn)可疑突變；

■ 全基因組測序（8個(gè)患者；平均測序深度31.35X到57.77X,后續(xù)進(jìn)行常規(guī)WGS數(shù)據(jù)分析，沒有發(fā)現(xiàn)可疑突變，針對FCMTE1候選區(qū)域的多核苷酸重復(fù)序列ExpansionHunter特殊分析）；

■ PCR驗(yàn)證檢測到的重復(fù)序列；

■ 公共表達(dá)數(shù)據(jù)分析；

研究結(jié)果

•  縮小FCMTE1致病區(qū)域的基因組范圍

基于11個(gè)家系的連鎖分析，獲得的最大LOD值分布為1.64-3.77，都處于8q24區(qū)域(下表)。單倍型分析提示FCMTE1致病區(qū)域的最小范圍在rs800532和D8S1112之間, 為包含21個(gè)基因的4.9M區(qū)域。

 

• 常規(guī)WGS分析未能在此區(qū)域檢測到基因突變
• 重點(diǎn)關(guān)注4.9M區(qū)域內(nèi)的多核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增

研究者將233個(gè)重復(fù)motif（4.9M區(qū)域內(nèi)檢測到的多核苷酸重復(fù)序列），利用ExpansionHunter進(jìn)行重復(fù)序列擴(kuò)增挖掘。通過對比8名患者和9例對照的序列，研究者發(fā)現(xiàn)7名患者的SAMD12基因4號內(nèi)含子都存在一個(gè)5核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列(TTTTA)n，而9名對照全部未檢測到。由于這個(gè)重復(fù)擴(kuò)增序列比測序長度（150bp）還要長，研究者進(jìn)一步分析了患者的未能成功進(jìn)行基因組比對的序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在患者的Alu element和(TTTTA)n重復(fù)序列之間，存在另一個(gè)5核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列(TTTCA)n，并且這個(gè)擴(kuò)增序列在數(shù)據(jù)庫尚無記錄（UCSC Genome Bioinformatics）（下圖為SAMD12基因4號內(nèi)含子內(nèi)(TTTCA)n突變堿基的示意圖）。

 

• 確認(rèn)(TTTCA)n插入序列可能是FCMTE1的致病原因

對11個(gè)家系的先證者進(jìn)行長片段PCR和重復(fù)引物PCR，確認(rèn)11個(gè)家系的先證者都攜帶(TTTCA)n插入序列。在另外9個(gè)未進(jìn)行連鎖分析的家系患者中，有7個(gè)家系通過重復(fù)引物PCR檢測到了(TTTCA)n插入序列。對于攜帶這一突變的所有家系樣本的重復(fù)引物PCR和長片段PCR結(jié)果，確定(TTTCA)n插入序列與疾病共分離；(TTTCA)n在患者中重復(fù)次數(shù)至少為105次；119個(gè)中國對照均不攜帶這種(TTTCA)n插入序列。

• (TTTTA)n和其他突變基本不可能是FCMTE1的致病原因

對于文章一開始發(fā)現(xiàn)的(TTTTA)n重復(fù)序列，研究者發(fā)現(xiàn)部分患者會(huì)在攜帶(TTTCA)n插入序列的染色體上攜帶這個(gè)重復(fù)序列，重復(fù)數(shù)為25–44，而部分對照攜帶的重復(fù)數(shù)能達(dá)到800。對于119例對照來源的238條8號染色體，這個(gè)(TTTTA)n重復(fù)序列重復(fù)數(shù)在11 到80+，其中3.36% (8/238) 的染色體攜帶的重復(fù)次數(shù)超過80；基于20個(gè)家系患者的編碼區(qū)和剪切區(qū)一代測序，也未能找到任何其它突變。

•  基于FCMTE1家系的奠基者效應(yīng)分析

基于5個(gè)有基因組SNP分型數(shù)據(jù)的家系，研究者針對(TTTCA)n附近5個(gè)連鎖LD區(qū)域中的92個(gè)SNP進(jìn)行奠基者效應(yīng)分析。結(jié)果顯示，這5個(gè)家系都攜帶含有(TTTCA)n的一個(gè)核心單倍型。這個(gè)單倍型在千人組計(jì)劃中國人群的頻率約為0.226（47/208）。進(jìn)一步利用3個(gè)日本家系和5個(gè)家系共有的59個(gè)SNP進(jìn)行奠基者效應(yīng)分析，結(jié)果表明這個(gè)含有(TTTCA)n的核心單倍型為8個(gè)家系即中國人和日本人所共有。

• 攜帶(TTTCA)n插入序列的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況

SAMD12基因在數(shù)據(jù)庫中共有8種轉(zhuǎn)錄本，其中4個(gè)轉(zhuǎn)錄本覆蓋(TTTCA)n插入序列所在位置。在腦組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫中，最長的轉(zhuǎn)錄本（覆蓋(TTTCA)n插入序列位置）為主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。

  

研究方法和結(jié)果流程圖

• 鑒定了SAMD12基因內(nèi)含子區(qū)的五核苷酸（TTTCA）n重復(fù)插入為FCMTE1的致病突變。 FCMTE1致病突變的發(fā)現(xiàn)可以指導(dǎo)其他類型FCMTE致病基因的鑒定。隨著測序技術(shù)和生物信息學(xué)工具的發(fā)展，我們應(yīng)該更多地關(guān)注分子病因未知的神經(jīng)退行性疾病的致病性重復(fù)擴(kuò)增。
• 基于WGS數(shù)據(jù)的重復(fù)序列擴(kuò)增突變挖掘，是本研究確定致病突變的關(guān)鍵。
• 這種重復(fù)序列擴(kuò)增引發(fā)神經(jīng)毒性的可能假設(shè)有三個(gè)：（i）擴(kuò)增的RNA（pre-mRNA）聚集形成核RNA團(tuán)簇，其隔離了關(guān)鍵的RNA結(jié)合蛋白并阻礙它們執(zhí)行其正常功能; （ii）擴(kuò)展的RNA可以不按常規(guī)翻譯產(chǎn)生導(dǎo)致神經(jīng)毒性的短肽;（iii）擴(kuò)增可能導(dǎo)致相關(guān)基因功能的獲得或喪失。

 

特別說明：這么精彩的文章，實(shí)際上還涉及到更加精彩和激烈的中日比拼。在2018年的4月，日本團(tuán)隊(duì)率先在NG發(fā)表了SAMD12基因內(nèi)含子中的核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致良性成人家族性肌陣攣癲癇(benign adult familial myoclonic epilepsy,BAFME)。因此，中國團(tuán)隊(duì)在時(shí)間上稍稍落后，最后將成果發(fā)表于《Brain》雜志。

 

特別感謝

天昊生物特別感謝浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科羅巍教授以及其課題組對天昊生物技術(shù)和服務(wù)的認(rèn)可！天昊生物將長期致力于為分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究者提供高質(zhì)量的科研策略咨詢、實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)和遺傳數(shù)據(jù)分析，幫助廣大科研人員獲得更為優(yōu)質(zhì)的科研成果！