【昊綜述】環(huán)狀RNA全方位觀察：從生物發(fā)生到功能

發(fā)稿時間：2018-07-03來源：天昊生物

摘要：環(huán)狀RNA綜述

 

環(huán)狀RNA (circRNA)是一類具有封閉環(huán)狀結構，并且不易降解的RNA分子。雖然第一個circRNA早在40多年前就被發(fā)現(xiàn)的，但是人們對它的大規(guī)模研究卻是近十幾年的事情。今年7月剛剛在Wiley Interdiscip Rev RNA上發(fā)表的綜述性文章“A 360^o view of circular RNAs: From biogenesis to functions”，就詳細總結了環(huán)狀RNA的生物發(fā)生和功能等研究進展情況。

 

前言

 

由于大多數(shù)真核基因是以分段的方式排列的，新生轉錄本通常需要被剪接，去掉非編碼內含子后，使得外顯子彼此結合。人們早已認識到，基因表達中的這一步驟受到高度調控，利用這種機制可以從特定基因中產生多種mRNAs，每個成熟的亞型可以具有獨特的功能、定位模式或調節(jié)作用。在人類基因組中，95 %以上的基因是具有可變剪接的，它們通常由順式調節(jié)元件和反式作用因子共同調控。這其中，除了產生各種線性mRNA之外，許多真核基因也產生出具有末端共價連接的環(huán)狀RNA。

 

通過名為反向剪接（backsplices）的剪接機制，mRNA前體被剪切后，其剪切供體會連接到上游剪切受體上，例如圖1中外顯子2的末端連接到外顯子2的起始段，便會形成circRNA。盡管第一個circRNA早在40多年前就被鑒定出來，但這些轉錄本在細胞中基本上被認為是非常罕見的，所以長期被人們忽略。近期研究表明，多數(shù)circRNA較難產生，并且積累水平較低，但有些表達水平比相關的線性mRNA都高10倍，這也暗示一些蛋白質編碼基因的主要功能可能是產生circRNA，而不是線性mRNAs或蛋白質。

 

 

圖1、mRNA前體可以通過選擇性剪接產生線性mRNA或者circRNA。如果mRNA前體剪接位點(ss)以線性順序連接，則產生成熟的線性mRNA，成功的被加帽和多聚腺苷酸化。或者，mRNA前體通過“backsplices”的剪接機制，使得5’ ss與其上游3’ ss剪接受體結合，從而產生末端由3’-5’磷酸二酯鍵共價連接的circRNA

 

本文重點回顧了過去幾年來在揭示細胞中存在的circRNA多樣性方面取得的巨大研究進展，并討論這些轉錄本是如何生成、調控和發(fā)揮功能的。

 

對circRNA的早期認識

circRNA最早是在1976年人們研究類病毒（viroids）如何作為植物病原體發(fā)揮作用時被發(fā)現(xiàn)的。以前已知類病毒與病毒相似之處在于它們具有傳染性和致病性，但尚不清楚類病毒是如何起作用的，因為它們看起來是相當小的RNA (<400 nt)，并且沒有蛋白質外殼的保護。通過對純化的類病毒RNA分子研究，S?nger等人證明類病毒RNA無法對其3’端和5’端進行標記，也無法被蛇毒磷酸二酯酶降解。電子顯微鏡結果顯示類病毒RNA結構上呈現(xiàn)一種單鏈環(huán)的形狀。隨后Gross等人1978年發(fā)表在Nature上的文章，對類病毒進行了測序并證明它們確實是真正的circRNA。之后在circRNA領域雖然取得了一些成果，但直到20世紀90年代人們才成功鑒定出高等真核生物中表達的第一個內源性circRNA。Nigro等人通過對一個腫瘤抑制基因-結直腸癌缺失基因（DCC）幾個異常剪接轉錄本的分析，發(fā)現(xiàn)在一些轉錄本中，外顯子3似乎位于外顯子2的上游，這些被打亂的轉錄本似乎沒有被聚腺苷酸化，但為正常剪接DCC轉錄本表達量的約1/1000。隨后對人ETS-1也有類似的研究，發(fā)現(xiàn)了高度穩(wěn)定的circRNA(半衰期>48 h)。

之后研究也證明circRNA可以是某些蛋白質編碼基因的主要輸出形式，并且對小鼠Sry基因的研究提出了關于如何選擇特定外顯子進行環(huán)狀化的第一個機制見解，即在Sry外顯子旁的內含子中存在約50kb的近乎完全互補的序列，可以形成circRNA，暗示這些側翼序列可能能夠彼此堿基配對，從而將剪接供體定位在靠近其上游剪接受體的位置，并有利于反向剪接。與該模型一致，利用質粒實驗也顯示細胞中Sry外顯子的環(huán)化確實需要存在兩個反向重復。在使用核提取物檢測體外反向剪接時，同樣顯示內含子反向重復促進了circRNA的產生，特別是當外顯子尺寸增加時。這些體外實驗進一步有力地表明，circRNA是由剪接體產生的，但反向剪接可能比典型剪接反應效率低100倍以上。在隨后的幾年中，又發(fā)現(xiàn)了一些內源性circRNA，并發(fā)現(xiàn)外顯子跳躍和反向剪接有時緊密相連。直到后來高通量RNA-seq方法的興起，circRNA的廣泛而重要的作用才被揭示出來。

 

高通量測序技術引發(fā)circRNA研究的興起

大約從10年前開始，許多研究者開始使用RNA-seq來表征“完整”轉錄組，來鑒定各種先前未標記的剪接變體和非編碼RNA。然而，這些初步分析遺漏了circRNA。這在很大程度上是由于兩個原因導致：一是在文庫制備方案中廣泛使用了poly(A)富集步驟，從而丟失了circRNA和缺乏poly(A)尾巴的其他轉錄本信息；二是使用了要求RNA-seq讀數(shù)以線性方式與基因組對齊的計算算法，從而導致以反向剪接方式連接的所有reads被丟棄。直到Salzman等人在2012年利用RNA-seq試圖識別由染色體重排引起的癌癥特異轉錄本時，才意外的發(fā)現(xiàn)了成千上萬在細胞中表達的circRNA。在這項研究中，他們從白血病細胞中鑒定出數(shù)百個外顯子順序混亂的轉錄本，但令人驚訝的是，這些轉錄本絕大多數(shù)也在正常細胞中觀察到。這表明這些異常的RNA不是由于基因組DNA的結構重排，而是由于在所有細胞中活躍的剪接過程造成的。它們同樣缺少poly(A)，并且對消化幾乎所有線性RNAs的RNase R具有抗性。

 

隨后的RNA-seq研究證實了這些初步觀察，并鑒定了數(shù)以千計的circRNA，這些circRNA是從包括后生動物、植物、真菌和原生動物在內的各種真核生物的蛋白質編碼基因中產生的。這些假定的circRNA中的許多已經被收錄到幾個在線數(shù)據(jù)庫中，包括circBase、CIRCpedia和CircInteractome。一般來說，在給定的細胞類型中，可以從超過10%的表達基因中檢測到circRNA，并且circRNA的水平與其相應的mRNA之間通常沒有明確的相關性。大多數(shù)circRNA是組織特異性的，表達水平較低，但也有一些在多個物種中表達較高，并且有數(shù)百個基因以比標準線性mRNA更高的水平表達。這在神經系統(tǒng)尤其如此。例如，在果蠅中，90%以上注釋的circRNA可以在頭部檢測到，而這些轉錄本的一半在任何其他組織中都沒有檢測到。由于circRNA在神經發(fā)生過程中經常上調，并可在突觸中富集，因此有人認為它們可能對神經元功能有反應和/或調節(jié)作用。

 

 

circRNA的高通量鑒定

用去核糖體RNAs (rRNAs)和使用隨機引物的RNA-seq，已成為目前鑒定circRNA的主流方法。此外，在許多方案中，會進一步采用核酸外切酶如RNase R或poly(A)富集步驟來去掉線性mRNAs。另外，目前也已出現(xiàn)了包含有反向剪接探針的芯片。在計算方面，已經開發(fā)了多條可以從RNA-seq數(shù)據(jù)集中識別circRNA的管線，包括find_circ、CIRI、KNIFE、NCLScan、Segemehl、DCC、UROBORUS和PTESFinder等。盡管所有這些算法都支持circRNA的識別，但是它們預測的circRNA集合確實也存在顯著差異的情況。有研究曾將相同的RNA-seq數(shù)據(jù)集被獨立地輸入到五個算法中時，許多(~40%)假定的circRNA僅由單個算法預測出。預測的circRNA總數(shù)從1532個到4067個不等，所有五種算法僅鑒定出854個共有circRNA。因此，各種算法在靈敏度和精度上存在較明顯差異，目前該領域缺乏從RNA-seq數(shù)據(jù)集識別circRNA的金標準方法。因此，本文建議使用多個獨立的管線來鑒定circRNA候選物，并隨后使用獨立的方法對候選物進行驗證，包括包含有反向剪接點的RT-PCR和Northern blotting。隨著RNA-seq分析算法的進一步改進，計算消除噪音和僅識別真正的circRNA也會變得更加容易。

 

 

內含子重復之間的堿基配對有利于circRNA的產生

所有內部外顯子(不包括基因的第一個和最后一個外顯子)在其3’端和5’端都有剪接信號，理論上都可以被環(huán)化。然而，在細胞中只觀察到一小部分的反向剪接事件發(fā)生，部分原因是這些反應經常以極低的效率發(fā)生。當真的發(fā)生反向剪接時，它可以產生包含單個外顯子的圓形RNA，該外顯子通常比平均表達的外顯子長，或者包含多個外顯子的circRNA。最常見的circRNA有2-3個外顯子，內部內含子被去除。因為環(huán)狀外顯子旁的內含子通常比平均值長。2013年的一篇研究發(fā)現(xiàn)，在人類circRNA周圍尋找到豐富的內含子重復基序，通常觀察到成對的Alu重復元件( ~ 300-nt長)。這種排列類似于小鼠Sry circRNA旁側序列中的互補內含子重復序列，暗示了內含子重復可能是反向剪接的共同驅動因素。事實上，在人類、小鼠、豬、秀麗隱桿線蟲和果蠅中，許多高表達的circRNA兩側都常有互補的重復序列，并且可以通過簡單地在側翼內含子中搜索互補序列來準確預測許多circRNA。除了Alu重復元件(靈長類特有的)之外，各種互補序列可以側翼于circRNA，包括非重復序列。因此，目前認為大多數(shù)反向剪接事件不需要特定的序列基序(在剪接位點之外)，而是通過側翼內含子元件之間的堿基配對相互作用來促進。

通過使用表達質?；蛲ㄟ^使用CRISPR-Cas9從內源基因座中去除內含子重復，人們已經證明了內含子重復之間的堿基配對確實可以促進circRNA的生物發(fā)生。但由于基因組重復在物種之間存在顯著差異，因此不同的真核生物可以表達不同的circRNA。即使蛋白質編碼外顯子在進化上是保守的，基因的最終輸出和功能可能在生物體之間也會有所不同。

在一些基因座中，短內含子重復(~30-nt，包括簡單重復)之間的堿基配對能夠促進circRNA的產生。盡管如此，內含子重復的存在并不總是足以引發(fā)反向剪接，因此，circRNA可以以組織特異性的方式表達。這是由于剪接、熱力學、RNA結合蛋白調節(jié)共同轉錄的特性，以及大多數(shù)內含子含有競爭堿基配對的多個重復元件決定的。根據(jù)重復元件之間的堿基配對方式，可以產生非常不同的剪接異構體(圖2)。當堿基配對發(fā)生在不同的內含子上時，會誘導反向剪接，產生由插入的外顯子組成的circRNA。相反，當堿基配對在單個內含子內局部發(fā)生時，發(fā)生標準剪接以產生線性mRNA。重復元件的數(shù)量、它們之間的距離以及它們的互補程度都影響序列堿基配對，從而影響剪接結果。這種競爭還允許單個蛋白質編碼基因產生多個不同的circRNA，這一過程稱為可變環(huán)化。

 

 

 

圖2、內含子重復序列之間的堿基配對有助于反向剪接事件發(fā)生。(a)黑腹果蠅laccase2基因的外顯子/內含子結構，突出顯示可產生490-nt circRNA的外顯子2。一對DNAREP1_DM轉座子(紅色箭頭)插入側翼外顯子2。這些內含子序列之間的堿基配對，有利于反向剪接發(fā)生。(b)當mRNA前體中存在多個內含子重復元件(紅色箭頭)時，根據(jù)彼此的重復堿基對(用灰色弧線表示)，可以產生不同的成熟RNA。a-c為不同內含子中重復序列之間的堿基配對導致反向剪接并產生包含單個外顯子(a和c)或多個外顯子(b)的circRNA。d相反，當在單個內含子堿基對中彼此重復時，產生線性mRNA

 

外顯子跳躍常常與circRNA的生成有關

最近的全轉錄組分析表明，一些circRNA的生物發(fā)生可以與外顯子跳躍（或稱外顯子跳讀）事件偶聯(lián)，進而允許從單個mRNA前體產生線性mRNA和circRNA (圖3)。在某些情況下，外顯子跳躍的mRNA變體以非常低的水平表達，并且僅可通過RT-PCR檢測，而不是通過RNA-seq檢測。Barrett等人在2015年對mrps16基因的研究中完美地展示了外顯子跳躍和circRNA產生之間的強耦合現(xiàn)象。將mrps16基因的外顯子1與外顯子3剪接導入含有外顯子2的內含子套索中，隨后會再次剪接以將外顯子2的起點和終點連接在一起。由此，這一重新發(fā)生的事件產生了成熟的circRNA，潛在的細節(jié)雖然尚未完全知曉，但將外顯子跳躍與circRNA產生耦合的實驗，提供了在沒有內含子重復的情況下產生circRNA的另一種發(fā)生機制。

 

 

 

圖3、外顯子跳躍可直接與circRNA產生偶聯(lián)。在mrps16基因上，外顯子跳躍導致成熟的線性mRNA以及含有外顯子2的內含子套索的產生。這種套索被重新拼接以產生成熟的circRNA

 

 

通過RNA結合蛋白調控circRNA水平

除了順式作用的內含子重復和外顯子跳躍事件之外，RNA結合蛋白也是circRNA的關鍵調節(jié)子，它們允許這些轉錄本以組織特異性模式表達或者隨著細胞改變而被誘導/抑制。例如，內含子重復本身可以直接與反式作用因子結合，包括NF90/NF110或者結合雙鏈RNA的RNA解旋酶DHX9。DHX9結合可抑制反向剪接反應，可能是通過直接解鏈雙鏈內含子區(qū)，或通過募集ADAR (作用于RNA的腺苷脫氨酶)酶將腺苷轉化為肌苷。由于DHX9在分化過程中上調，有人提出，這些DHX9驅動的機制可使細胞主動抑制多種circRNA的產生。另一方面，選擇性剪接因子QKI促進了人類上皮-間充質轉化(EMT)過程中數(shù)百個circRNA的產生。這似乎是因為QKI與側翼內含子結合并形成二聚體，從而使插入的剪接位點非常接近(類似于反向重復如何促進反向剪接)。果蠅(Mbl)蛋白同樣可以結合自身mRNA前體中的內含子元件，以促進circRNA的產生，從而自動調節(jié)宿主基因表達，并確保Mbl蛋白水平保持在一個嚴格的范圍內。

 

circRNA的生成可以可以進一步被FUS以及由多個hnRNP和SR蛋白質調控。如上所述，果蠅laccase2 circRNA的產生通過內含子重復元件之間的堿基配對來促進，但其表達也受到多個hnRNPs和SR蛋白的抑制。有趣的是，這些剪接因子的同時缺失導致laccase2 circRNA水平的增加，這表明每個因子在影響剪接決定方面起著非冗余作用。因此，circRNA以組合方式受到控制，內含子重復通常提供了發(fā)生反向剪接的機會，以及各種微效的調控?？紤]到每個外顯子或內含子都有自己獨特的一組蛋白結合位點，人們可以很容易地想象這種編碼如何被用來產生各種不同的circRNA表達模式。

 

當剪接機制受限時基因輸出方式轉向circRNA

盡管突變剪接位點可以導致circRNA無法生成，在果蠅上的研究發(fā)現(xiàn)，當細胞中的核心剪接體或轉錄終止因子不足時，circRNA可以成為首選的基因輸出形式。核心剪接體成分的缺失導致接合的線性mRNA表達降低。與此形成鮮明對比的是，我們發(fā)現(xiàn)，當細胞中功能截然不同的因子從剪接體中耗盡時，許多單外顯子環(huán)狀RNA，包括laccase2 circRNA的表達增加。

 

在剪接體組裝的早期過程，特別是在外顯子初始鑒定的機制中，較好的詮釋了經典剪接和反向剪接之間敏感性的差異(圖4)。在外顯子定義期間( Berget，1995 )，U1和U2 snRNPs結合在每個外顯子的相對端，并由蛋白質-蛋白質相互作用來加以穩(wěn)定，該作用網絡包括附加因子，例如SR蛋白質。然后，這些外顯子相互作用必須轉化為交叉內含子相互作用(將剪接位點與獨立內含子配對)，以產生經典剪接的線性mRNA。然而，為了產生circRNA，這些初始外顯子復合物可能不會被破壞，而是可以直接轉化為有催化能力的反向剪接復合物。當核心剪接體從細胞中耗盡時，交叉外顯子相互作用不容易被交叉內含子相互作用取代，從而使單個外顯子circRNA成為首選的剪接結果。目前還不清楚反向剪接是否使用與標準剪接反應完全相同的核心剪接體成分，但這項工作為思考如何獲得circRNA水平的整體變化(至少是由單個外顯子產生的變化)提供了參考。如果一個組織具有有限數(shù)量的剪接體成分，預計將產生更高水平的circRNA，特別是高度轉錄的基因。因此，確定這一模型在產生最高數(shù)量circRNA的神經元或衰老組織中是否成立將是非常有意義。

 

 

圖4、剪接體組件決定標準拼接或反向剪接發(fā)生模型。在具有長內含子的mRNAs前體中，剪接體組件首先在每個外顯子上組裝。U1 snRNP (紅色)和U2 snRNP (綠色)分別識別5’端和3’端的剪接位點，另外一些因子，如SR蛋白，用于穩(wěn)定外顯子復合體。這些跨外顯子的相互作用必須被跨內含子的相互作用取代，以便產生成熟的線性mRNA (左)。然而，當剪接體的活性受到限制時(例如由于核心剪接體組件的耗盡)，跨外顯子的相互作用可能不容易被破壞，而完全剪接體聚集在外顯子上，導致反向剪接的產生（右）

 

circRNA可以調控microRNA的活性和水平

一旦circRNA生成后便可以自然抵抗外切核酸酶降解，并作為穩(wěn)定轉錄本積累(例如，統(tǒng)計了60個人類circRNA半衰期中位數(shù)為約24小時)。那么circRNA的分子功能是什么呢？超過99.9%的已鑒定circRNA，功能仍然未知。在已知功能circRNA中，一些用于調控microRNA。microRNA是一種約21-nt的小RNA，通過與mRNA堿基配對和抑制蛋白質產生和/或引發(fā)mRNA降解而在轉錄后發(fā)揮作用(圖5a)。通過在circRNA中尋找保守的microRNA靶向位點，例如小鼠Sry circRNA含有16個miR-138結合位點，而CDR1as則含有70多個miR-7進化保守的結合位點。因此，這些circRNA可以用作誘餌或海綿，降低了游離miR-138或miR-7轉錄本的數(shù)量。CDR1as衍生自反義長非編碼RNA，CRD1as中存在約70個miR-7結合位點，沒有一個與miR-7完全互補，miR-7允許circRNA緊密結合但不被miR-7切割。與這一觀點一致，耗盡細胞中的CDR1as將導致miR-7靶mRNAs下調，可能是因為miR-7不再被隔離導致。CDR1as還含有與miR-671幾乎完全互補的區(qū)域，這使得circRNA能夠以依賴于miR-671的方式被Argonaute2 (AGO2 )核內切割。這就產生了一種模型，其中CDR1as有助于儲存和/或運輸miR-7 (與Argonaute蛋白結合)，直到miR-671切割circRNA，釋放miR-7，從而可以調節(jié)mRNA在特定亞細胞位置的表達(圖5a)。

 

 

 

圖5、circRNA可以具有多種分子功能。(a)一些circRNA，包括CDR1as和Sry，能夠結合許多拷貝的特定microRNA，響應于特定刺激，circRNA可能釋放這些microRNA轉錄本，然后這些轉錄本結合到mRNA可以下調它們的表達。(b)最近研究表明，來自同一基因座的線性mRNAs和circRNA可以被翻譯成不同的蛋白質產物。在所示的實施例中，成熟的線性mRNA (頂部)和circRNA (底部)使用相同的AUG起始密碼子(綠色)，但是circRNA產生截短的蛋白質，該蛋白質終止于反向剪接連接后遇到的終止密碼子。(c)擬南芥SEP3 circRNA的一些拷貝保留在細胞核中，在內源SEP3基因座形成R環(huán)( RNA:DNA雜交體)，影響宿主基因的可變剪接

 

在小鼠中，CDR1as circRNA在興奮性神經元中高度表達，在抑制性神經元、膠質細胞或非神經元組織中表達最少。在除去CDR1as基因區(qū)域后，敲除小鼠是存活的、可育的，并且在成人腦解剖結構中沒有顯示嚴重異常。但也觀察到興奮性突觸傳遞的缺陷，敲除小鼠表現(xiàn)出感覺運動控制受損，這是一種與神經精神障礙相關的行為表型。這些效應可能是由于CDR1as circRNA的缺失導致。

 

因此，CDR1as基因座很好地展示了circRNA和microRNA如何具有重要生物學效應的動態(tài)相互作用，但對于其他circRNA是否以類似方式發(fā)揮作用仍有待進一步研究。這是因為多數(shù)帶注釋的circRNA含有較少的microRNA結合位點。然而，有新的證據(jù)表明，包括人類和果蠅中的許多circRNA可能起到海綿吸附特異性microRNA的作用。例如，當人表皮干細胞分化時誘導的circZNF91含有24個miR23b-3p結合位點，這是已知的調節(jié)角質細胞分化的microRNA。由于在分化過程中上調的其他circRNA也具有數(shù)量顯著的microRNA結合位點，有人預測，當細胞改變狀態(tài)時，一部分circRNA可能會吸附關鍵的microRNA，因此確定circRNA有助于緩沖調節(jié)網絡免受干擾將是有趣的研究。

 

circRNA的翻譯

最初的實驗表明，由于缺乏5’端帽子結構，真核核糖體不能裝載到circRNA上，因此認為無法翻譯。但后來證明，內部核糖體進入位點（IRES）的存在使得合成的circRNA能夠在體外和細胞中翻譯。IRES元件存在于多種病毒中，直接結合翻譯起始因子或核糖體本身，從而允許翻譯以獨立于帽子的方式發(fā)生。因為最初的報道沒有發(fā)現(xiàn)與核糖體共沉淀的circRNA或核糖體圖譜庫，看來內源性circRNA可能無法募集核糖體。然而，最近有報道指出，內源性circRNA的一個子集實際上可能被翻譯。

 

人circ-ZNF609包含753-nt開放閱讀框，與線性mRNA有相同的AUG密碼子和終止密碼子，該終止密碼子在反向剪接連接處遇到三個核苷酸(圖5b)。這種circRNA與多聚體和表達質粒共同沉積的一小部分但很重要的部分顯示，circ-ZNF609可以被弱翻譯(效率比線性mRNA低兩個數(shù)量級)。有趣的是，circ-ZNF609的敲除導致人和小鼠成肌細胞的增殖缺陷，但來源于circ-ZNF609的蛋白質是否有助于這種表型的產生仍不得而知。

 

利用質譜技術，鑒定出另外19個人類包含內源性circRNA反向剪接點的的多肽。深度測序數(shù)據(jù)集也揭示了122個與核糖體相關的果蠅circRNA。對于40%的這些果蠅circRNA，翻譯預計使用與宿主線性mRNA相同的起始密碼子，并在反向剪接連接點后終止。許多預測的ORFs至少有一個可識別的蛋白質結構域，但必須指出，目前只有一個測序read支持絕大多數(shù)這些翻譯事件。幾乎不可能用核糖體圖譜來尋找圓形RNA上的核糖體定相或起始/終止密碼子，因此使用mini基因表達質粒、蔗糖梯度離心、突變分析和質譜的組合來進一步驗證這些circRNA中的一些確實可以翻譯的假設。值得注意的是，該研究表明circRNA翻譯可能經常發(fā)生在膜相關核糖體上或富含膜(例如突觸)的亞細胞結構中。

 

與預期一致，當插入雙順反子報告子構建體時，circRNA起始密碼子上游的區(qū)域具有可檢測到的IRES活性。對于circZNF609，IRES活性需要剪接，這表明外顯子連接復合體的沉積可能會增強一些circRNA的翻譯。進一步研究證明，N6-基腺苷( m6A )殘基在circRNA中富集 (約13 %的circRNA含有m6A )，這些修飾的核苷酸可以促進翻譯。事實上，單個m6A位點可能足以啟動合成circRNA的翻譯。結合m6A后，YTHDF3 reader蛋白質將翻譯起始因子，包括eIF4G2和eIF3A被招募到circRNA上。

 

由于基于全基因組的研究未能獲得circRNA能夠翻譯的任何證據(jù)，這些最近描述的翻譯事件中有許多可能代表技術或生物噪聲?，F(xiàn)在需要進一步的工作來確定有多少circRNA被真正翻譯達到顯著水平。人們很容易推測，在circRNA的長壽命期間可以產生大量蛋白質，并且這些內源性蛋白質可以充當顯性陰性和/或調節(jié)與其相關的宿主線性mRNA產生的蛋白質相同的功能。除了自身翻譯之外，有越來越多的證據(jù)表明，一些circRNA，包括circPABPN1，可以調節(jié)它們相關的線性mRNA的翻譯。還發(fā)現(xiàn)成熟的circRNA與多種其他蛋白質結合，這表明這些轉錄本可能影響多種其他蛋白質活性或功能。

 

細胞核內的circRNA調節(jié)宿主基因的轉錄和選擇性剪接

大多數(shù)表征的circRNA主要位于細胞質中，但現(xiàn)在出現(xiàn)了在細胞核中起作用的circRNA的例子。外顯子-內含子circRNA不完全剪接，具有保留的內含子，允許它們與U1 snRNP相互作用并促進宿主基因的轉錄。在擬南芥中，一個關鍵的發(fā)育調控基因SEPALLATA3 ( SEP3 )的外顯子6產生一個circRNA，這些環(huán)狀轉錄物中約15%保留在細胞核中(圖5c)。值得注意的是，過度表達SEP3 circRNA (但不是外顯子6的線性轉錄本)的植物產生的花比正常植物雄蕊少，花瓣多。這似乎是因為外切表達的circRNA在內源SEP3基因組基因座形成R環(huán)(RNA:DNA雜交)，這導致跳過外顯子6的線性SEP3剪接變體的產量增加(圖5c)。由于該SEP3剪接變體的過度表達足以引起與SEP3 circRNA的過度表達相同的同源異型表型，因此該circRNA似乎僅通過調節(jié)其宿主基因的可變剪接發(fā)揮作用。circRNA究竟是如何做到這一點尚待確定，但有人提出，R環(huán)導致SEP3轉錄暫停，從而可以招募促進外顯子跳躍的可變剪接調節(jié)因子。值得注意的是，擬南芥中約5%的Rloops對RNase R處理具有抗性，表明其他circRNA也可以結合基因組DNA來調節(jié)轉錄或可變剪接模式。

 

免疫系統(tǒng)與環(huán)狀RNA的相互作用

考慮到某些circRNA，包括類病毒和HDV是病原體，人們會期望真核生物免疫系統(tǒng)能夠以某種方式感知和消滅這些外來入侵者。事實上，當HeLa細胞被使用自剪接體I內含子體外制備的circRNA轉染或剪接連接時，大量眾所周知的識別受體，包括RIG-I和MD5，以及其他先天免疫調節(jié)子和細胞因子被強烈誘導。因此，細胞能夠對外源circRNA產生顯著的免疫應答，這種應答實際上比將編碼相同序列的線性RNA轉染到細胞中時更強。人們對circRNA的感知還不完全清楚，但一些重要的方面已經被揭示出來。首先，RIG-I是免疫應答所必需的，并與外源circRNA共定位。其次，circRNA轉錄本是自我還是非自我的形成機制被認為是關鍵決定因素。每當使用自剪接I組內含子制備circRNA時(即使是在來自表達質粒的細胞中制備)，觀察到強有力的免疫應答。與此形成鮮明對比的是，使用剪接體制備的circRNA總是被認為是自我的(不管成熟circRNA或其側翼內含子的序列如何)。這大概是因為剪接體在circRNA上沉積了許多RNA結合蛋白，例如外顯子連接復合體或核輸出機制，這些RNA以某種方式將circRNA標記為自身。以這種方式，細胞能夠感應和應答多種外源circRNA，而不管它們的主要序列如何，同時對許多內源circRNA不產生應答。現(xiàn)在還需要進一步的工作來理解RIG-I如何準確識別外來circRNA，以及剪接體反向剪接如何防止自身免疫反應。

 

除了確保識別外源circRNA之外，多種免疫調節(jié)子，包括RIG-I和dsRNA結合蛋白NF90/NF110，似乎也調節(jié)內源性環(huán)狀RNA的表達。在正常生長的細胞中，NF90/NF110與位于許多(~30%)外顯子旁的內含子中富含A/U的元件(包括堿基配對的Alu元件)結合，這些外顯子產生circRNA并起到促進反向剪接事件的作用。然而，在病毒感染時，NF90/NF110穿梭于細胞質以結合病毒轉錄本并抑制病毒復制，這導致NF90/NF110結合細胞核中較少的新生mRNA前體，從而導致circRNA的產生減少。有趣的是，NF90/NF110還能夠結合細胞質中一些成熟的circRNA，并且實際上比線性RNA對circRNA表現(xiàn)出更高的親和力。因此，正常生成的circRNA允許在細胞質中建立NF90/NF110的分子庫，當需要時，可以釋放該分子庫，以便能夠對病毒感染作出迅速反應。

 

circRNA在衰老和疾病中的作用

可變剪接模式已經顯示隨著老化而改變。隨著果蠅、秀麗線蟲和小鼠衰老，神經系統(tǒng)中circRNA表達有增加的趨勢。例如，在2513個檢測到的果蠅circRNA中，262個在20日齡頭部中與1日齡相比顯著上調。值得注意的是，這些表達的增加在很大程度上與宿主基因中線性mRNAs表達的變化無關，并且在衰老小鼠心臟或恒河猴肌肉中沒有觀察到，這表明circRNA可能在老化的神經系統(tǒng)中首先穩(wěn)定生成，但目前尚不清楚這種circRNA的積累是保護性的、有害的還是無害的。至少在小鼠身上，從Pwwp2a基因衍生的circRNA似乎有助于防止病理性肥大和心力衰竭。

 

與正常組織相比，癌細胞z中的circRNA通常下調表達，這可能部分由于細胞分裂稀釋造成。與這一觀點一致，最近發(fā)現(xiàn)，隨著細胞分化和增殖停止，circRNA水平經常增加。下調一些circRNA，可以促進細胞生長，過表達則促進增殖。特別值得注意的是，當斷點堿基對兩側的內含子序列彼此相鄰時，癌癥相關染色體易位可導致異常融合circRNA的產生，這些融合circRNA可促進轉化、細胞活力和抗性治療，因此代表了新的治療靶點。此外，因為一些circRNA存在于外體/胞外囊泡和體液中，circRNA可能代表有希望的癌癥生物標志物。將circRNA包裝成囊泡可能是從細胞中消除circRNA的一種方式和/或實現(xiàn)細胞間通信的機制。

 

circRNA研究展望

RNA-seq現(xiàn)已鑒定出數(shù)千個circRNA，但仍需記住，絕大多數(shù)RNA從未通過正向技術驗證或詳細研究過。因此，要從這些列表中消除測序假象，區(qū)分反向剪接事件事件，以及完全表征circRNA表達模式，還有許多工作要做。然而，越來越多的circRNA現(xiàn)在已經被足夠詳細地研究，因此我們對它們如何產生、調節(jié)和功能有了重要的認識。特別是對生物發(fā)生機制的深入了解已經轉化為在細胞中表達circRNA的有效方法，并使一些circRNA的功能得以揭示。通過將過表達研究與CRISPR-Cas9產生的circRNA敲除結合起來，未來幾年可能會確定更多circRNA的功能。應該可以使用CRISPR-Cas9去除側翼內含子重復元件，從而剔除感興趣的circRNA，同時不影響宿主基因的線性RNA產生。

 

內含子重復對于許多circRNA的生物發(fā)生至關重要(圖2)，但對于基因如何在沒有重復的情況下產生circRNA仍不完全了解。例如，在人表皮干細胞分化過程中，大部分circRNA上調或果蠅沒有側翼重復，并且不清楚這些外顯子是如何被選擇用于反向剪接的。除了外顯子跳躍事件(圖3)，可能還有許多順式和反式調節(jié)機制有待發(fā)現(xiàn)，這些機制能夠實現(xiàn)特定的circRNA表達模式。此外，還需要進一步研究，以了解反向剪接反應的詳細機制，并確定是否涉及所有規(guī)范的核心剪接體組件。

 

一旦產生了circRNA，人們對它們是如何在細胞質中積累，特別是在非分裂細胞中積累的知之甚少。其他種類RNA的特定結構特征被受體蛋白識別，使得這些轉錄本能夠被帶到核孔復合體中以輸出到細胞質中。circRNA可能存在類似的機制，更好地理解與circRNA相互作用的蛋白質，特別是在它們的生物發(fā)生過程中，可能有助于揭示circRNA定位是如何被控制并在發(fā)育過程中如何改變的。對于那些與核糖體相關的circRNA (圖5b)，核糖體在轉錄物上的組裝到底是怎樣的，所產生的蛋白質積累到足夠高的水平以具有生物學效應？大量未翻譯的circRNA可能有助于形成大型RNA-蛋白質復合物，或者以其他方式影響與其親本基因產生的蛋白質相同的途徑?；蛘?，circRNA的產生本身可能是關鍵的功能事件，因為反向剪接反應可用于降低線性mRNA的表達或終止讀通轉錄事件。

 

內源性circRNA是如何被識別為自身的，是否有可能在體外產生不引起免疫反應的環(huán)狀RNA？這一途徑可以開辟許多生物技術應用，在這些應用中，用持久的circRNA用于治療細胞或病人可能是理想的。許多circRNA具有較長的半衰期，但circRNA最終降解的機制仍不清楚。CDR1as circRNA可以被AGO2切割，但這似乎是一個孤立的機制。其他RNA內切核酸酶通?？梢酝ㄟ^提供外切核酸酶的接入點來促進circRNA的衰變，并且快速降解的circRNA的鑒定可以提供定義這種機制的起點。綜上所述，近幾年在circRNA研究中許多令人驚訝的發(fā)現(xiàn)已經被揭露出來，這個領域已經準備好揭露更多關于這些轉錄本是如何被調節(jié)和作用，以影響正常和疾病狀態(tài)的見解。

 

注：封面circRNA電鏡圖來源文章：Circular single-stranded RNA replicon in Saccharomyces cerevisiae, Proc. Nadl. Acad. Sci. USA, 1990

 

 

 

 

關于天昊

 

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