【昊閱讀】最新文獻(xiàn)為您比較安捷倫、羅氏、Illumima和RRBS四種甲基化測(cè)序平臺(tái)

發(fā)稿時(shí)間：2018-07-18來(lái)源：天昊生物

在高等真核生物中，DNA甲基化是基因組表觀遺傳調(diào)控的基礎(chǔ)。目前，我們已經(jīng)有全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）技術(shù)，可以覆蓋基因組的所有甲基化位點(diǎn)，但這一技術(shù)的價(jià)格目前仍然比較昂貴，數(shù)據(jù)分析也非常的復(fù)雜。因此，對(duì)于生物學(xué)活動(dòng)相關(guān)基因組高CpG區(qū)域的捕獲，將能實(shí)現(xiàn)更高性價(jià)比的甲基化水平檢測(cè)。目前，這種覆蓋基因組~10%甲基化位點(diǎn)的“甲基化測(cè)序平臺(tái)”主要包括兩類，一類是基因探針雜交捕獲后進(jìn)行測(cè)序（簡(jiǎn)稱甲基化捕獲），主要包括安捷倫公司，羅氏公司，Illumina公司的甲基化捕獲平臺(tái)；另一種是基于Mspl酶切的RRBS（Reduced Representation Bilsulfite seuqneing,RRBS）平臺(tái)，即基于限制性酶的RRBS測(cè)序平臺(tái)。這兩類技術(shù)都可以獲得達(dá)到單堿基分辨率的甲基化水平檢測(cè)結(jié)果，因此結(jié)果都比較準(zhǔn)確，有利于后期的驗(yàn)證階段工作。在甲基化標(biāo)志物篩選研究中，都是非常關(guān)鍵的技術(shù)。

 

今天，小編和大家一起閱讀一篇技術(shù)平臺(tái)比對(duì)最新文章，看看現(xiàn)今的4種甲基化測(cè)序平臺(tái)，各有什么樣的優(yōu)劣勢(shì)。

文章題目：“Same difference”: comprehensive evaluation of four DNA methylation measurement platforms

雜志：Epigenetics Chromatin. 

影響因子：5.351

發(fā)表時(shí)間：2018-05

 

• 本文對(duì)比的四種甲基化測(cè)序平臺(tái) （4個(gè)平臺(tái)均覆蓋人類基因組甲基化譜的10-13%）

 (1) 基于酶切的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序-RRBS平臺(tái)

(2) 基于捕獲的Agilent SureSelect Methyl-Seq ---安捷倫SSMethylSeq平臺(tái)

(3) 基于捕獲的Roche NimbleGen SeqCap Epi CpGiant---羅氏CpGiant平臺(tái)

(4)基于捕獲的 Illumina TruSeq-Methyl capture EPIC--- Illumina TruSeqEpic平臺(tái)

 

 

• 四種甲基化測(cè)序平臺(tái)覆蓋度比較

 

安捷倫SSMethylSeq 和 Illumina TruSeqEpic 主要是針對(duì)一條DNA鏈進(jìn)行捕獲；但是某些含有SNP的DNA區(qū)域，Illumina TruSeqEpic 技術(shù)平臺(tái)也會(huì)針對(duì)2條DNA鏈都進(jìn)行捕獲；RRBS，羅氏CpGiant可以從2條DNA鏈都進(jìn)行片段捕獲。依據(jù)下圖（左），RRBS 的片段獲取長(zhǎng)度約為84-334bp（文庫(kù)制備膠回收步驟的人為選擇），這一長(zhǎng)度范圍和安捷倫SSMethylSeq 技術(shù)平臺(tái)較為接近。而羅氏CpGiant捕獲區(qū)域通常更長(zhǎng)，并且羅氏CpGiant和Illumina TruSeqEpic的長(zhǎng)度分布比較廣?；诓东@區(qū)域的重疊性分析（下圖右），3個(gè)捕獲平臺(tái)之間的捕獲區(qū)域重疊性較高。但可以觀察到，4個(gè)平臺(tái)的靶向區(qū)域還是有一定差別的。

 

• 實(shí)驗(yàn)操作參數(shù)比較

 

依據(jù)上表的參數(shù)對(duì)比，RRBS需要的DNA用量最低，而安捷倫SSMethylSeq需要至少1μgDNA。價(jià)格上，4種平臺(tái)的價(jià)格都很低廉，僅占WGBS（全基因組甲基化測(cè)序）的3.3~15.5%。

 

• 序列比對(duì)情況和正負(fù)鏈平等性情況比較

 

依據(jù)下圖（左），四個(gè)平臺(tái)的唯一比對(duì)序列占比平均能達(dá)到72.8%（SD=7.5%）。相比較而言，RRBS的未匹配序列或者模糊匹配序列占比較高（粉色和灰色區(qū)域）。下圖（右）再一次強(qiáng)調(diào)了，安捷倫SSMethylSeq 和 Illumina TruSeqEpic 主要是針對(duì)一條DNA鏈進(jìn)行捕獲；而RRBS，羅氏CpGiant，WGBS可以從2條DNA鏈都進(jìn)行片段捕獲。這一點(diǎn)對(duì)于關(guān)注鏈特異性甲基化水平的研究者比較關(guān)鍵。

 

•  CpG理論靶向區(qū)域的覆蓋率情況

對(duì)于CpG位點(diǎn)測(cè)序read≥10的位點(diǎn)，我們定義為CpG單元。下圖（左）統(tǒng)計(jì)了不同技術(shù)平臺(tái)對(duì)于不同類型CpG單元的統(tǒng)計(jì)值。ERRBS, SSMethylSeq, CpGiant  (平均都能獲得121M的雙端測(cè)序read), TruSeqEpic 約獲得54M的雙端測(cè)序read) 三個(gè)平臺(tái)獲得的CpG單元數(shù)量約為3.84M；而WGBS獲得的測(cè)序量約為300M的read，覆蓋的CpG單元約為14.4M。對(duì)比各個(gè)技術(shù)平臺(tái)，ERRBS平均覆蓋了其理論靶的CpG單位區(qū)域的67.9％。 而羅氏CpGiant則平均覆蓋了其預(yù)期CpG單位區(qū)域的98.3％（下圖右）。

 

• CpG重疊單頁(yè)的甲基化水平檢測(cè)一致性（下圖左側(cè)MA圖）

對(duì)于重疊檢測(cè)到的CpG位點(diǎn)，4種平臺(tái)的甲基化水平一致性很高，說(shuō)明甲基化水平檢測(cè)在不同平臺(tái)之間主要是檢測(cè)區(qū)域的差別，而檢測(cè)出的甲基化水平是高度一致的。

 

• 基因功能區(qū)域的覆蓋情況對(duì)比 

甲基化捕獲平臺(tái)為預(yù)先設(shè)計(jì)探針，重點(diǎn)捕獲已知在表觀調(diào)控中扮演重要作用的基因組功能區(qū)域，例如CpG島、CpG shore，啟動(dòng)子區(qū)，部分內(nèi)含子和外顯子區(qū)，因此三個(gè)捕獲平臺(tái)對(duì)基因功能區(qū)的覆蓋情況差別不大。RRBS也能覆蓋相同的區(qū)域，但覆蓋度偏低一些（下圖 a）。對(duì)于在未注釋基因區(qū)域，RRBS 技術(shù)平臺(tái)覆蓋度最高(下圖c）。

 

 

• 總結(jié)

1. 總的來(lái)說(shuō)，對(duì)于其目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域，每個(gè)平臺(tái)都有很高的捕獲效率，但是不同平臺(tái)的捕獲區(qū)域還是有一定差別的。SSMethylSeq和CpGiant覆蓋大約70％的相同CpG，TruSeqEpic和其它捕獲方法捕獲的共同CpG約為40-50％，而RRBS只有~30％的捕獲區(qū)域與其他捕獲方法重疊SSMethylSeq，CpGiant和TruSeqEpic在他們?cè)O(shè)計(jì)的捕獲區(qū)域中覆蓋率超過(guò)90％，而RRBS對(duì)其預(yù)期靶向區(qū)域的覆蓋率約為70％。因此，基于捕獲的甲基化測(cè)序平臺(tái)比RRBS更精確地覆蓋了它們的預(yù)期靶向區(qū)域。

2. RRBS可提供與捕獲平臺(tái)相當(dāng)?shù)腃pG數(shù)據(jù)，但在CpGs譜中提供更多的可變性（即未知區(qū)域的數(shù)據(jù)）。

3. 甲基化水平檢測(cè)在不同平臺(tái)之間主要是檢測(cè)區(qū)域的差別，而檢測(cè)出的甲基化水平是高度一致的。

4. 安捷倫和羅氏還為甲基化的測(cè)量設(shè)計(jì)個(gè)性化定制捕獲。

5. 安捷倫SS Methyl Seq捕獲平臺(tái)可用于低質(zhì)量DNA（降解）的甲基化水平檢測(cè)，是FFPE組織的一個(gè)理想甲基化檢測(cè)平臺(tái)。