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祝賀!天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)助力客戶登陸Science of the Total Environment

發(fā)稿時(shí)間:2019-07-01來源:天昊生物


 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳巍課題組近期在《Science of the Total Environment》上發(fā)表了高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應(yīng)用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細(xì)菌群落的影響的文章。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí),我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目:High-throughput absolute quantification sequencing reveals the effect of different fertilizer applications on bacterial community in a tomato cultivated coastal saline soil

中文題目:高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應(yīng)用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細(xì)菌群落的影響

期刊名Science of the Total Environment    

影響因子: 5.589

研究概要:

濱海鹽漬土是一種重要的后備土地資源,具有很高的農(nóng)業(yè)利用潛力。本研究采用高通量微生物16S絕對定量方法,研究了4種不同施肥方式(100%生物有機(jī)肥、70%生物有機(jī)肥和30%化肥、30%生物有機(jī)肥和70%化肥、100%化學(xué)肥)對番茄鹽漬土壤細(xì)菌群落組成的影響。田間試驗(yàn)結(jié)果表明,70%生物有機(jī)肥加30%化肥是沿海灘涂地區(qū)發(fā)展番茄栽培(提高產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì))的最佳劑量。盆栽試驗(yàn)對番茄的生長也有類似的結(jié)果,同時(shí)表明70%生物有機(jī)肥加30%化學(xué)肥料對土壤微生物群的活化效果最好。肥料對土壤養(yǎng)分的輸入增加了細(xì)菌的總豐度(比初始土壤增加了3倍),同時(shí)導(dǎo)致土壤中細(xì)菌多樣性的顯著喪失。其中以變形桿菌、擬桿菌和厚壁菌為主的門是微生物群落轉(zhuǎn)變的主要原因,特別是在70%生物有機(jī)肥和100%化肥處理的土壤中,其富集程度顯著。RDA和皮爾遜相關(guān)分析表明,土壤養(yǎng)分,特別是有效磷、有效鉀和土壤鹽分是影響該生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子,但有機(jī)質(zhì)含量和土壤酸堿度也在微生物群落的組裝中起著重要作用。

研究背景:

鹽漬土在世界范圍內(nèi)廣泛分布,占地球表面的8%。我國鹽漬土總面積為3.67×107ha,其中30%具有農(nóng)業(yè)利用價(jià)值。濱海鹽漬土是鹽漬土的一個(gè)亞類,是江蘇省重要的潛在土地資源。中國沿??偯娣e2.17×106ha,其中95%為潮間帶,江蘇約占1/4。此外,由于黃河和長江的大量泥沙淤積,該地區(qū)的灘涂以每年50-200米的速度擴(kuò)張。因此,沿海鹽漬土(灘涂地區(qū))被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)發(fā)展的儲備地,具有很大的潛力,可以緩解我國土地資源不足的壓力。

然而,沿海灘涂地區(qū)由于其高鹽度,通過高滲透脅迫、營養(yǎng)缺乏、毒性和不良的物理土壤條件抑制了大部分作物,因此沿海灘涂地區(qū)通常具有植物生長不良和微生物活性低的特點(diǎn)。因此,除了培育耐鹽植物品種外,還需要可持續(xù)的生物技術(shù)來提高沿海鹽土的質(zhì)量,特別是那些通過植物根系和微生物群之間的互作來發(fā)揮作用的技術(shù)。為了提高土壤肥力和作物產(chǎn)量,人們嘗試了各種技術(shù)來改良沿海鹽漬土,包括化學(xué)、物理、生物和工程改良。例如,Liu等人(2015)發(fā)現(xiàn),在牛糞、石膏和一種新的改良劑產(chǎn)品的應(yīng)用中,牛糞通過引入豐富的有機(jī)質(zhì)(OM),從而提高土壤微生物活性,在改善濱海鹽土性質(zhì)方面取得了富有希望的成果。此外,Chen等人(2016)的研究表明,施用富含真菌木霉菌的生物有機(jī)肥可使鹽地堿蓬的生長量增加83%,并顯著改變土壤微生物生物量。顯然,有機(jī)堆肥或生物功能性有機(jī)肥與不同比例的化肥的結(jié)合在這一領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。在農(nóng)業(yè)中,富含有益微生物的有機(jī)生物肥與化肥的結(jié)合使用,是提高土壤肥力,增加土壤有機(jī)質(zhì)、孔隙、持水能力和微生物活性,同時(shí)減少化肥施用總量(可能導(dǎo)致沿海生態(tài)系統(tǒng)次生鹽堿化)的一種很有前景的途徑。

土壤微生物群落在調(diào)節(jié)植物耐鹽性和提高鹽漬土壤質(zhì)量中起著關(guān)鍵作用。然而,對于微生物群對鹽漬土中外源添加的反應(yīng),尤其是在這種情況下細(xì)菌群落的裝配動(dòng)力學(xué),人們知之甚少。在過去的十年中,高通量測序極大地?cái)U(kuò)大了我們對不同生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落的理解,雖然這種方法對于確定樣本中不同微生物類群的相對豐度很有價(jià)值,但是它并不能準(zhǔn)確提供不同樣本間目標(biāo)微生物豐度差異的信息。最近,研究人員開始使用絕對定量16S rRNA測序方法來解決這一領(lǐng)域的技術(shù)挑戰(zhàn)。本研究的目的是:1)用微生物絕對定量方法揭示不同施肥條件下鹽漬土細(xì)菌群落的變化,揭示土壤微生物組成與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。2)在番茄盆栽和田間試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定沿海鹽漬土生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的最佳施肥量。

田間試驗(yàn)場地及設(shè)計(jì):

野外試驗(yàn)場位于江蘇省大豐市的潮坪地區(qū),面對黃海,該地區(qū)屬北亞熱帶季風(fēng)氣候,四季分明,年平均降雨量1058毫米,年平均氣溫15°C,年平均日照2280小時(shí),具有典型的濱海鹽漬土。本研究所采用的肥料為商業(yè)化生物有機(jī)肥(雞糞中添加107孢子/g 的植物益生菌木霉菌NJAU 4742),化肥包括尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。設(shè)計(jì)了以下田間施肥處理:1)100%生物有機(jī)肥(100BF),2)70%生物有機(jī)肥和30%化肥(70BF),3)30%生物有機(jī)肥和70%化肥(30BF),4)100%化肥(CF)。每種施肥方式都有五個(gè)重復(fù)地塊,每個(gè)地塊為8.0 m2(4.0 m×2.0 m),長有21株4周齡的番茄幼苗。在2018年期間,番茄植株生長100天,并記錄了有關(guān)番茄產(chǎn)量數(shù)據(jù),五個(gè)植株(帶水果)被從地里轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。

盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì):

為了更有效地研究不同施肥對鹽漬土微生物群的影響,從田間試驗(yàn)相同區(qū)域(0-20cm深)采集了200kg的土壤,并轉(zhuǎn)移到玻璃房進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)進(jìn)行了兩次,施肥處理與田間試驗(yàn)相同。每種處理有5個(gè)盆栽,每個(gè)盆栽含有2.8kg的土壤和1個(gè)番茄幼苗。在自然光條件下,隨機(jī)放置在20-30°C的玻璃室內(nèi)。種植后第42天,按照上述田間試驗(yàn)方法采集植物樣本,土壤樣本在同一天從每個(gè)盆栽中采集。

樣品制備和分析:

測定土壤化學(xué)性質(zhì),包括土壤鹽漬度、土壤pH值、總磷、總鉀、硝態(tài)氮、有效磷和有效鉀。在田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中,對每株植物的株高和莖粗進(jìn)行人工記錄,然后對植物樣品(莖和根)進(jìn)行干燥,以測量干重和進(jìn)行營養(yǎng)分析(如測定番茄果實(shí)中的維生素C含量、NO3-含量、總蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量)。

16S擴(kuò)增子絕對定量測序

為了觀察施肥前后土壤微生物群的變化,未施肥初始土壤樣品也被納入分析。因此從盆栽試驗(yàn)的四個(gè)處理(CF、30BF、70BF和100BF)中收集的20個(gè)土壤樣品加上5個(gè)初始土壤樣品被送往上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S擴(kuò)增子絕對定量測序(V4-V5區(qū)域)。

 

研究結(jié)果:

田間試驗(yàn)番茄產(chǎn)量與品質(zhì)

  •  鹽漬地番茄產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)受施肥影響較大(表1)。在四種施肥方式中,70BF處理的番茄產(chǎn)量顯著最高。70BF處理使番茄產(chǎn)量分別比CF、30BF和100BF提高了17.2%、25.9%和23.6%。經(jīng)生物有機(jī)肥(BF)處理的番茄(30BF、70BF、100BF)其蛋白質(zhì)含量隨生物有機(jī)肥施用量的增加呈增長趨勢,而果實(shí)中硝酸鹽的積累呈相反的趨勢。四種處理間可溶性糖積累無顯著性差異。生物有機(jī)肥(BF)處理的番茄根系生長量比化肥(CF)處理的番茄根系生長量增加,表現(xiàn)為根系干生物量。


 

 表1田間試驗(yàn)中不同處理對番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及根系生長的影響

  •  此外,表2中所示的番茄植株生長和營養(yǎng)特性表明,生物有機(jī)肥施用(30BF、70BF、100BF)比化肥(CF)處理的植株生長更好,磷吸收更高。在三種BF處理中,70BF和100BF處理的株高顯著高于30BF。


 

2田間試驗(yàn)中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

盆栽試驗(yàn)中番茄生長及土壤性狀的研究

  •   盆栽試驗(yàn)中番茄幼苗的生長(表3)證實(shí)了田間四種施肥方式對番茄生長影響的結(jié)果。此外,盆栽試驗(yàn)中30BF和CF處理的根系生長(以根系干重表示)比田間試驗(yàn)增加更顯著,而四種處理之間的莖徑無顯著差異。

 

3盆栽試驗(yàn)中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

  • 同時(shí),與初始未施肥土壤(CK)相比,四種施肥方式對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響有顯著性差異(圖1)。具體來說,土壤中的酸堿度、硝酸鹽氮和有效(AK)呈明顯的下降趨勢,按CF>30BF>70BF>100BF的順序排列。經(jīng)生物有機(jī)肥(BF)改良后的土壤中的OM和有效(AP)明顯高于CF處理后的土壤和CK土壤。施肥土壤中的陽離子量(以ECe值表示),相對于對照樣品中的陽離子量,無論肥料輸入的形式如何,累積了3.3-3.8倍。

 

1盆栽試驗(yàn)中不同施肥處理對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

土壤細(xì)菌群落的絕對定量

  • 清除模糊、低質(zhì)量序列和singleton OTU后,25個(gè)土壤樣本共得到5,282,236reads(含Spike-in序列),每個(gè)樣本生成的OTU數(shù)量從3124到4252不等,并由RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分類。生成的OTU的維恩圖顯示了核心微生物群,所有樣本中共享3331個(gè)OTU。根據(jù)Spike-in生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行微生物絕對定量。
  •  每克土壤的估計(jì)絕對拷貝數(shù)如圖2a所示,相應(yīng)的門水平相對豐度如圖2b所示。與未施肥的初始樣品(CK)相比,經(jīng)過肥料處理的樣品中細(xì)菌的總豐度增加了2.6-3.8倍,70BF樣品中細(xì)菌的總豐度顯著最高,其次是CF樣品。所有測試樣品中以Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria, Firmicutes, Planctomycetes, Acidobacteria為優(yōu)勢菌門。


 

2 所有土壤樣品中主要細(xì)菌門的絕對豐度(A,每克土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù))和相對豐度(B,%)。

  •  四種處理的土壤中細(xì)菌種類對施肥量的響應(yīng)不同,形成了具有不同α多樣性指數(shù)的群落(表S1),盡管施肥處理后的土壤細(xì)菌總數(shù)顯著增加,但這些樣品(CF、30BF、70BF和100BF)中的細(xì)菌多樣性較未處理土壤樣品(CK)明顯降低,其中,CF處理導(dǎo)致細(xì)菌多樣性的損失最大(顯示最低香農(nóng)值的多樣性)。
  • 根據(jù)PCoA(按Bray Curtis計(jì)算,如圖3a所示)和平均連鎖層次聚類(UPGMA,按Bray Curtis計(jì)算,如圖3b所示),用PCo153.64%)將初始土壤(CK)的細(xì)菌群落與四種施肥土壤的細(xì)菌群落明顯分離;PCo2(29.66%)將CF處理土壤的細(xì)菌群落與BF處理土壤的細(xì)菌群落明顯分離,相比之下,兩個(gè)較高的BF處理(70BF和100BF)不能清楚地彼此分離。

 

3 細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析(A,PCoA)和層次聚類樹(B)(以Bray Curtis計(jì)算)

  •  屬水平上進(jìn)行的熱圖分析(圖4)也顯示細(xì)菌群落組成的集群模式與PCoA觀察到的集群模式相似。在施肥處理(CF和BF系列)中,大多數(shù)被選的菌屬(前100個(gè))的絕對豐度明顯高于CK土壤,如圖所示,紅色/橙色柱狀物更多。此外,BF系列土壤的細(xì)菌組成比CF土壤中的細(xì)菌組成更均勻,如顏色強(qiáng)度所示。

 

4 土壤樣品中100個(gè)最豐富細(xì)菌屬的熱圖分析

 

細(xì)菌群落與土壤化學(xué)屬性的關(guān)系

  • 為了確定影響本研究鹽漬土壤細(xì)菌群落組成的因素,進(jìn)行了RDA(圖5)和Pearson相關(guān)分析。土壤樣本根據(jù)門水平細(xì)菌群落組成分為三組(圖5)。第一組分(RDA1)從肥料處理樣品(CF和BF系列)中分離出初始土壤樣品(CK),解釋了70.59%的變化。第二組分(RDA 2)僅解釋了18.98%的變異,并從BF系列樣品中分離出了CF樣品。土壤酸堿度與大多數(shù)優(yōu)勢種呈負(fù)相關(guān),其它5個(gè)土壤參數(shù)(包括土壤OM、EC、硝酸鹽N、有效磷和有效鉀)與細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(圖5)。例如,肥料處理土壤中的Bacteroidetes和 Proteobacteria含量較高,與土壤EC含量較高呈正相關(guān)。有趣的是,在六個(gè)試驗(yàn)土壤參數(shù)中,土壤中的HE-OM比其他五個(gè)參數(shù)的重要性要小。而土壤養(yǎng)分有效性參數(shù)如有效磷、有效鉀、硝酸鹽N、土壤ECe對鹽漬土微生物群落的驅(qū)動(dòng)作用較強(qiáng)。


5  RDA確定了構(gòu)成細(xì)菌群落的六個(gè)選定環(huán)境變量。

  •  此外,還計(jì)算了番茄根系生長與屬水平細(xì)菌絕對豐度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。根生物量與前30個(gè)屬中的15個(gè)(包括一些重要的屬,如Pseudomonas假單胞菌和Sphingopyxis)呈正相關(guān),還包括5個(gè)屬(Gp6、Sphingomonas鞘膜單胞菌、Chitinophaga、Rhizobium根瘤菌和Flavisolibacter),這些屬只有在加載有機(jī)物后才會(huì)富集。

 

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