天昊生物功能微生物項目新文：尸體腐爛會增加氮污染并改變飲用水和黃河水中nirK反硝化菌群落的演替

發(fā)稿時間：2020-09-11來源：天昊生物

英文題目： Corpse decomposition increases nitrogen pollution and alters the succession of nirK-type denitrifying communities in different water types

中文題目：尸體腐爛會增加氮污染并改變飲用水和黃河水中nirK反硝化菌群落的演替

期刊名：Science of the Total Environment

影響因子：6.551

尸體分解作為一種高質量的營養(yǎng)物質輸入，會對水體環(huán)境產(chǎn)生強烈的擾動，如導致高氮或高硝酸鹽污染。反硝化細菌可以將硝酸鹽還原為氮氣，從而減少氮污染，提高水生生態(tài)系統(tǒng)的自我凈化能力。然而，水體中的nirK反硝化菌群落對尸體分解的反應仍然是未知的。因此，我們采用高通量測序和化學分析方法，研究了自來水和黃河水中nirK型反硝化菌群落及其相應的對照組在兩個重要的魚尸體分解階段（即晚期漂浮腐爛和沉沒殘骸）中的演替。我們的數(shù)據(jù)顯示，實驗組的NH₄⁺-N濃度比對照組增加了大約3-4倍，Proteobacteria是nirK反硝化菌群落的優(yōu)勢類群。尸體群中富含Brucella和Achromobacter等幾種潛在致病菌屬。值得注意的是，尸體分解會顯著改變nirK反硝化菌群落結構。隨著演替的進行，尸體群的群落結構變得更加相似，表明群落組成在最后階段趨同。水體pH、氧化還原電位（ORP）和處理是影響群落結構的三個重要因素。但是，水體類型并不是決定尸體相關nirK反硝化菌群落的主要驅動因素。在反硝化菌群落中檢測到4個系統(tǒng)發(fā)育簇，但在尸體和對照組之間的分布有顯著差異。這些結果為深入了解動物尸體分解過程中nirK反硝化功能菌群和潛在致病菌提供了深入的認識，為環(huán)境評價和管理提供了有價值的參考。

實驗程序和采樣：

實驗于2018年7月進行。首先，我們從蘭州黃河段和當?shù)氐膶嶒炇宜堫^采集足夠的水到干凈的塑料桶中。從當?shù)佤~類批發(fā)市場購買紅錦鯉20條（體重78.52±0.95g），作為分解動物模型。所有魚均采用過量麻醉處死，然后將其隨機置于預先裝滿800ml水的塑料盒（20cm×18cm×15cm）中。將10個魚尸體分別放置在10個裝有自來水的盒子中，十個沒有任何尸體的裝有自來水盒子作為對照。同樣，剩余的魚尸體（n=10）被放置在盛產(chǎn)黃河水的盒子中，十個沒有任何尸體的裝有黃河水盒子作為對照。上述四組分別命名為TF（有尸體的自來水）、T（無尸體的自來水）、YF（有尸體的黃河水）和Y（沒有尸體的黃河水）。對魚尸體的觀察是在降解過程中開始的，我們收集了最后兩個階段的水樣：晚期漂浮腐爛（第15天）和沉沒殘骸（第19天）階段。每組有5個重復。從盒子中采集250 ml自來水，然后使用0.22μm纖維素膜過濾；用0.45μm濾膜過濾250ml黃河水，然后用0.22μm濾膜再次過濾。在提取DNA之前，將每個樣品的相應濾膜及時保存在?20°C下。此外，還收集了額外的水樣（約100-150 ml），用于測量以下理化性質。

理化性質分析：

對每個水樣品的理化參數(shù)進行分析，包括pH值、氧化還原電位（ORP）、電導率（CON）、氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）、總溶解固體（TDS）、鹽度（Salinity）和總有機碳（TOC）。

二代測序：

使用濾膜提取基因組DNA，然后進行nirK功能基因擴增子測序（583F/909R）。

尸體降解過程中環(huán)境因子的變化

幾乎所有的環(huán)境因素都受到尸體的影響。例如，尸體組的平均pH值在7.16至8.40之間，并且無論水體類型或時間點，始終顯著低于對照組（均p<0.05）。對照組的氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）值在5.12～15.12之間，而在尸體組氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）從16.83變?yōu)?/span>41.06，因此在魚腐爛過程中氨態(tài)氮增加了大約3～4倍。相對于對照，尸體組的鹽度和總溶解固體（TDS）分別增加了約100倍和10倍。相對于對照，尸體組的ORP也顯著增加。而總有機碳（TOC）在實驗組和對照組之間幾乎沒有變化，除了Y和YF組。另外，兩個尸體組在各時間點的水質理化因子，如NH₄⁺-N、pH、ORP、CON、TDS、鹽度等均無顯著性差異，說明兩組尸體雖然水體類型不同，但環(huán)境條件相似。在尸體降解過程中，實驗組NH₄⁺-N、pH和TOC在第15-19天呈上升趨勢，而ORP、CON、TDS和鹽度則呈相反趨勢。

測序結果

本研究共收集40份樣本進行DNA提取和PCR擴增，但有3份未能成功擴增，從37個水樣中共獲得3226302條序列，質量調(diào)整后，共獲得1769047條序列（每個樣本平均47812條序列）。用Framebot 進行移碼矯正后，去除嵌合體、singletons和數(shù)據(jù)標準化后，每個樣本精簡到3282條序列，并根據(jù)97%的核苷酸相似度將所有序列聚類為543個OTUs。OTU水平上，樣本的Goods coverage（平均值±SE）為99.10%±0.05%，說明測序數(shù)據(jù)覆蓋了大部分水體反硝化菌群落多樣性。此外，稀釋性曲線趨于平坦，表明測序結果反映了絕大多數(shù)的群落信息。

對照組與魚尸組nirK反硝化菌群落α多樣性的差異

對于α多樣性，ANOVA分析顯示尸體分解對nirK反硝化菌群落的α多樣性值無顯著影響，只有水體類型對Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs有顯著影響。此外，Mann-Whitney U檢驗檢驗顯示Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs等指數(shù)在對照組和尸體組也沒有表現(xiàn)出顯著差異（圖1）。此外，環(huán)境因素與α多樣性之間沒有顯著相關性。

尸體分解過程中不同組間nirK反硝化菌群落β多樣性比較

使用NMDS分析在尸體分解的兩個階段（晚期漂浮腐爛和沉沒殘骸）黃河水和自來水中nirK反硝化菌群落成員關系（基于Jaccard 距離）和結構（基于Bray-Curtis具體）上的差異（圖2）。首先，除5T和5TF外，nirK反硝化菌群落的群落成員組成和結構與對照組相比有顯著差異；PERMANOVA和ANOSIM分析（表1）進一步證明了這些差異，表明尸體分解顯著改變了水中反硝化菌群落的群落成員和結構。第二，4TF（第15天有魚尸體的自來水）和4YF（第15天有魚尸體的黃河水）之間存在微弱差異，而5TF（第19天有魚尸體的自來水）和5YF（第19天有魚尸體的黃河水）之間沒有顯著差異，這表明盡管不同的水類型，尸體降解過程使nirK反硝化菌群落的成員組成和結構更加相似，PERMANOVA和ANOSIM分析也證實了這一結果。最后，4TF與5TF以及4YF和5YF無顯著性差異，說明同一類型水體的反硝化菌群落在不同階段間無顯著差異。

尸體分解過程中水體中nirK反硝化菌群落的組成

在門水平上，水體中nirK反硝化菌群落主要由Proteobacteria組成（平均相對豐度為81.73%），其次為未分類細菌（18.27%）（圖3）。為評估尸體分解過程中Proteobacteria豐度的變化，采用單向方差分析比較不同組間Proteobacteria平均相對豐度的變化，值得注意的是，黃河水體組Proteobacteria的平均相對豐度在漂浮腐爛晚期和沉沒殘骸期在尸體組顯著高于對照組，而自來水中Proteobacteria的平均相對豐度僅在漂浮腐朽晚期（第15天）在尸體組略有增加。

在屬水平上，nirK反硝化菌群落以Sinorhizobium (47.43%)、Pseudomonas (9.52%)、Achromobacter (3.75%)、Ensifer (3.09%)、Agrobacterium (2.16%) 、 Brucella (2.02%)為主。其他稀有屬（平均相對豐度<1%）包括Rhizobium、Mesorhizobium、Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas、Starkeya、Alcaligenes、Ochrobactrum、Chelativorans、Pusillimonas、Roseobacter（圖4）。為了確定在尸體腐爛過程中發(fā)生顯著變化的屬，還使用了單向方差分析來比較不同組之間屬的平均相對豐度的變化。自來水中，從對照組到尸體組，Sinorhizobium的平均相對豐度顯著增加，而Rhodopseudomonas在第15天顯著減少，而在第19天TF組Bradyrhizobium明顯減少。在黃河水中，Mesorhizobium的平均相對豐度在第15天從對照組到尸體組均無明顯下降，第19天，YF組的Brucella數(shù)量顯著增加。

LEfSe分析也用于區(qū)分自來水和黃河水中尸體組和對照組之間的豐富類群（圖5），在自來水和黃河樣品中分別檢測到17個和11個生物標志物，LDA值均超過3.6。在自來水中，TF組中差異豐度最高的細菌有lcaligenaceae、Burkholderiales、Betaproteobacteria、 Achromobacter、Brucellaceae、Brucella、 Ochrobactrum，而對照組T中差異最豐富的成員是Ensifer、Rhizobiaceae、Rhizobiales、Alphaproteobacteria（圖5a）。在黃河水中，LEfSe分析鑒定出Brucella、Brucellaceae、Agrobacterium、Alcaligenes在尸體組YF中富集，而對照組Y的生物標志物則是Alphaproteobacteria 和Rhizobiales（圖5b）。

魚腐爛條件下環(huán)境參數(shù)對nirK反硝化菌群落的影響

環(huán)境因子與前10個屬的相關性如圖6所示。在屬水平上，Spearman相關分析表明，pH值與Sinorhizobium（r=-0.571，p<0.01）、Achromobacter (r = ?0.715, p < 0.05)、 Brucella (r = ?0.647, p < 0.01)、Rhizobium (r = ?0.421, p < 0.01) 、 Mesorhizobium (r=?0.473, p < 0.01)呈顯著負相關，pH值與Bradyrhizobium（r=0.570，p<0.01）和Rhodopseudomonas（r=0.493，p<0.01）呈正相關。RDA進一步表明，pH值與不同屬間有很強的相關性。NH₄⁺-N和ORP與菌屬間的相關性與pH值相反，NH₄⁺-N與Sinorhizobium(r=0.330,p<0.05)、Pseudomonas(r=0.367,p<0.05)、Achromobacter (r = 0.720, p < 0.01)、 Brucella (r = 0.517, p < 0.01)呈正相關；與Bradyrhizobium (r = ?0.605, p < 0.01) and Rhodopseudomonas (r = ?0.488, p < 0.01) 呈負相關。

為了探討環(huán)境因素對nirK反硝化群落成員組成和結構的影響，mantel檢驗表明，在Jaccard和Bray-Curtis距離上，pH是影響nirK反硝化群落的最顯著因素，其次是ORP、處理、NH₄⁺-N、TDS、鹽度、水類型和CON（表2）。

與尸體降解相關的核心反硝化細菌

與尸體降解相關的核心反硝化微生物根據(jù)所有尸體樣本中至少80%的樣本中出現(xiàn)的OTUs來確定。核心微生物（31個OTU）占nirK反硝化群落的78.23%相對豐度（圖7a）。核心OTUs成員中大部分（45.26%）屬于Pseudomonas，第二優(yōu)勢成員隸屬于Rhizobiaceae（UG），占所有核心OTU的14%（圖7b）。OTU4_s_Achromobacter xylosoxidans與pH、NH ₄⁺ -N呈正相關，與ORP呈負相關（圖7c）。

nirK反硝化群落的系統(tǒng)發(fā)育聚類分析

nirK反硝化核苷酸的系統(tǒng)發(fā)育鄰域連接分析表明，65個優(yōu)勢OTU（平均相對豐度>0.1%）分為四個聚類（圖8）：聚類1以Sinorhizobium（14個OTU）為主，聚類2以Pseudomonas（9個OTU）為主，聚類3個以Ensifer（1個OTU）為主，聚類4以未分類細菌（18個OTU）為主。在聚類1中，尸體組的OTUs相對豐度顯著高于對照組，而聚類4在對照組中顯著高于尸體組。

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