又一篇文章，再次闡明微生物相對定量不可以替代絕對定量

發(fā)稿時間：2018-12-11來源：天昊生物

 

英文題目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文題目：土壤絕對定量方法結(jié)合相對豐度能夠反映微生物類群的真實變化

期刊名：Scientific Reports

發(fā)表時間：2017年

研究背景: 

微生物在幾乎所有環(huán)境中的關(guān)鍵生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用，尤其在土壤中，微生物群落具有較高的分類多樣性和代謝潛力，可以作為反映主要生態(tài)過程的重要生物學(xué)指標。因此測定一些關(guān)鍵種群的豐度對于理解土壤中微生物群落的貢獻是相當重要的。隨著諸如Illumina MiSeq/Hiseq測序等高通量分子技術(shù)的迅速發(fā)展，可以容易地獲得相對豐度。然而由于相對豐度表示為總樣本中的相對比例，因此這種估計反映種群實際豐度的可靠性是不夠的。將相對豐度與絕對細菌密度相結(jié)合來估計種群絕對豐度，是深入分析自然環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要前提。細菌密度是微生物學(xué)中的一項基本指標，但其評價常常是單調(diào)乏味的，為了克服這一局限性，迫切需要快速、可靠的技術(shù)對各種環(huán)境中的微生物種群進行定量，特別是在生物多樣性極高的土壤中。

隨著與培養(yǎng)無關(guān)的測量技術(shù)發(fā)展，各種方法，包括細菌的直接計數(shù)、生化測量和核酸分子方法，已經(jīng)被用來定量微生物的絕對數(shù)量。最近，一些研究已經(jīng)比較了這些微生物定量方法。流式細胞術(shù)（FCM）和熒光顯微鏡（EM）是兩種強有力的直接計數(shù)方法，但。流式細胞術(shù)（FCM）在計數(shù)細菌細胞數(shù)量方面比基于目視觀察的熒光顯微鏡（EM）方法更為快速和準確。兩種方法均使用各種熒光染料對細菌細胞進行染色，如4′，6-二氨基-2-苯吲哚（DAPI）、吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI）和SYBR Green I（SYBR-I）等。三磷酸腺苷（ATP）作為所有活細胞的能量來源，幾十年來一直被認為是數(shù)量估計的潛在指標，ATP測定快速、穩(wěn)定、易于執(zhí)行，但用于估計細菌細胞數(shù)時，應(yīng)輔以FCM或EM。此外，利用16S rRNA基因特異性引物進行qPCR可作為快速靈敏的菌群定量方法。有研究比較了FCM、ATP、EM、qPCR等檢測技術(shù)在飲用水、廢水、活性污泥、底泥、土壤等不同環(huán)境條件下的細菌數(shù)量，幾乎所有的研究都證明FCM更適合于測定細胞數(shù)量。盡管FCM和ATP都被認為是用于細菌細胞數(shù)量定量的有力測量技術(shù)，但是這兩種方法需要一個土壤樣品的預(yù)懸浮程序，有效分離細菌細胞是評估微生物數(shù)量的關(guān)鍵。然而，對于哪種處理效果最好，目前尚無定論。

對于土壤基質(zhì)的狀態(tài)，定義為土壤有機質(zhì)活性組分總量的土壤微生物生物量可以通過提取微生物生化物質(zhì)的特定組分來定量。用氯仿熏蒸法測定微生物生物質(zhì)碳（MBC）的經(jīng)典方法是40年前發(fā)展起來的，但至今仍被廣泛應(yīng)用。此外，磷脂脂肪酸（PLFA）也可以作為細菌的生物標志物，為土壤微生物的優(yōu)勢群落表征提供靈敏可重復(fù)測定，而同時無需培養(yǎng)微生物。PLFA分析與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比有許多優(yōu)點，如準確度、定量、操作簡便，以及對微生物生理狀態(tài)和樣品保存時間沒有嚴格要求。然而，這些測量中存在的顯著差異，如FCM和PLFA，使得用相同的標準比較微生物數(shù)量變得困難。

隨著高通量核酸分子技術(shù)和微生物各種定量測定技術(shù)的發(fā)展，微生物群落的相對豐度和絕對微生物數(shù)量變得易于估算，Props等人結(jié)合高通量測序方法（16S rRNA基因）和FCM來定量冷卻水系統(tǒng)上的微生物類群絕對豐度，其結(jié)果表明相對豐度的增加不一定與絕對豐度的增加有關(guān)。Stammler等人表明將16S rRNA基因擴增子測序技術(shù)和qPCR技術(shù)相結(jié)合，可以為腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)提供新的見解。Smeet等人發(fā)明了一種在DNA提取過程中加入一個內(nèi)標的方法，通過16S rRNA基因擴增子測序技術(shù)可同時測定土壤細菌數(shù)量和群落組成。然而，結(jié)合絕對數(shù)值和相對數(shù)值來揭示不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的差異，目前仍然缺乏系統(tǒng)的研究。此外，不同氣候的土壤有利于進行微生物群落的比較，本研究收集了青藏高原和北京松山的不同草原土壤。利用Illumina MiSeq技術(shù)對微生物16S rRNA基因片段進行測序，分析微生物群落的相對豐度。應(yīng)用ATP、FCM、qPCR、PLFA和MBC等多種測量手段對所有微生物體的總數(shù)進行量化和系統(tǒng)比較。我們的結(jié)果表明，在微生物群落研究中，微生物物種的相對豐度不足以準確反應(yīng)物種的絕對豐度，因此細菌絕對豐度的定量分析對于微生物群落的綜合分析是必不可少的。

研究對象：

采集了位于青藏高原和北京松山的草原土壤，每個地點采集10個土壤樣本。

研究結(jié)果：

北京和西藏草原土壤中物種的相對豐度分析

從這兩個采樣點的20個樣本中總共獲得了1118928個序列，每個樣本獲得24931-83244個序列，DCA分析表明，兩個采樣點的微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同，這已由三種非參數(shù)多變量置換分析方法(MRPP、ANOSIM和ADOIS)證實。在門水平上進一步比較微生物分類學(xué)組成表明，46個門中的24個被所有樣本共享，其中9個門占每個樣本序列的90%以上，北京和西藏草地細菌門類中以變形菌門和放線菌門最多（圖1），其余7個門在兩處均占優(yōu)勢，包括Acidobacteria, Bacteroidetes,Verrucomicrobia, Planctomycetes, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Cyanobacteria。

 

圖1 兩個采樣點9個優(yōu)勢門的相對豐度

以95%置信區(qū)間(CI)對兩個采樣點之間主要門類的相對豐度和絕對豐度進行了響應(yīng)率分析(圖2a)，在主要門的相對豐度上，北京地區(qū)的Proteobacteria變性菌門顯著高于西藏，而Verrucomicrobia疣微菌門、Planctomycetes浮霉菌門和Cyanobacteria藍細菌門顯著低于西藏（圖2a）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對豐度和絕對豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

多種方法的微生物絕對定量結(jié)果比較

因為不同微生物絕對定量方法得到的樣品中微生物定量結(jié)果含有不同的單位，從而造成無法進行比較，通過換算，最終將所有微生物定量方法的定量結(jié)果全部換算為每克干土中所含細菌的細胞數(shù)或者16S拷貝數(shù)(表1)。ATP、FCM、qPCR和PLFA等定量方法的所有測試都顯示出良好的重復(fù)性，但MBC方法則與其他方法明顯不一致(圖3)。

 

表1 不同絕對定量方法測定的土壤樣品中的微生物生物量

 

圖3不同測量方法得到的細菌細胞數(shù)的比較

不同地點的微生物數(shù)量比較

不同的微生物定量方法表明兩個采樣點之間的微生物數(shù)量顯著不同(表1，圖4)。通過ATP方法發(fā)現(xiàn)，北京采樣點的細菌細胞數(shù)顯著高于西藏，這與FCM、qPCR和PLFA結(jié)果相似。而MBC方法發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)的細菌細胞數(shù)明顯低于西藏地區(qū)，這與其他方法不一致。此外，Pearson相關(guān)分析表明，除MBC外，其它指標均與環(huán)境因子（土壤水分和TOC）顯著相關(guān)，因此，MBC測量結(jié)果被排除在后續(xù)分析之外。

 

圖4 比較兩個采樣點之間的總細菌細胞數(shù)量（*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001）。

北京和西藏采樣點優(yōu)勢物種的估算絕對豐度(EAA)

我們將四種不同方法（ATP、FCM、qPCR和PLFA）測定的總細菌數(shù)量與優(yōu)勢門的相對豐度（16SrRNA擴增子測序）相結(jié)合。由于北京樣品的總微生物絕對細胞數(shù)明顯高于西藏，因此主要門的估計絕對豐度(EAA)（EAA定義為某微生物類群的相對豐度乘以總的絕對微生物細胞數(shù)）與利用ATP測定的相應(yīng)相對豐度呈現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢 (圖1和圖5)。對于變形菌門Proteobacteria，北京地區(qū)樣本的相對豐度和估計絕對豐度EAA均顯著高于西藏地區(qū)。

 

 

圖1 兩個采樣點優(yōu)勢門的相對豐度

 

圖5 兩個采樣點優(yōu)勢門的估計絕對豐度(EAA)

然而，一些優(yōu)勢門的估計絕對豐度EAA與對應(yīng)的相對豐度相比發(fā)生了顯著變化，例如北京地區(qū)樣本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相對豐度與西藏樣品無顯著差異，但北京地區(qū)樣本這些物種的估計絕對豐度EAA則顯著高于西藏樣品（圖2）。此外，北京地區(qū)Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對豐度顯著高于西藏，但是其估計絕對豐度EAA則無明顯差異（圖2）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對豐度和絕對豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

估計絕對豐度(EAA)與相對豐度和定量檢測之間關(guān)系的概念模型

與宏觀生態(tài)學(xué)一樣，相對豐度的差異也不適合解釋自然條件下微生物群落的真實豐度差異。在本研究中，我們將利用高通量測序方法得到的相對豐度與各種定量方法得到的絕對微生物量相結(jié)合，研究了土壤微生物群落的組成。根據(jù)我們的結(jié)果，我們提出了將相對豐度與定量結(jié)果相結(jié)合得到一個估算絕對豐度EAA的概念模型（圖6）。如圖6所示，在給定的群落1和群落2中(均有5個物種，每個物種一種顏色)，群落1有N個個體，群落2有M個個體，其中N大約是M的一半，計算每種顏色物種的相對豐度，同時將定量檢測與相對豐度相結(jié)合可得到估算絕對豐度EAA。當僅基于相對豐度時，我們發(fā)現(xiàn)群落1中紅色物種的相對豐度高于群落2，但把相對豐度與總微生物量結(jié)合在一起，轉(zhuǎn)化成估算絕對豐度EAA后，我們發(fā)現(xiàn)群落1中紅色物種的估算絕對豐度EAA則低于群落2。

 

圖6 估計絕對豐度(EAA)與相對豐度和定量檢測之間關(guān)系的概念模型

 

研究概要：

了解某些細菌類群的豐度變化，對土壤微生物學(xué)研究具有重要意義。然而，通過高通量技術(shù)觀察到的相對豐度的差異可能不能準確地反映實際分類單元的豐度。本研究旨在探討土壤微生物相對豐度分析與微生物定量方法是否存在耦合關(guān)系，對于描述不同地區(qū)土壤微生物種群分布是否更有意義。本文采用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物種的相對豐度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式細胞術(shù)(FCM)、定量實時PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多個與培養(yǎng)無關(guān)的技術(shù)直接或間接地定量細菌的絕對細胞數(shù)，通過對土壤微生物群落中主要組分的相對豐度和絕對豐度(EAA)的比較,發(fā)現(xiàn)Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Chloroflexi,Gemmatimonates， Planctomycetes等優(yōu)勢菌門的相對豐度和絕對豐度(EAA) 表現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢。這些結(jié)果表明EAA的變化在描述群落中種群的動態(tài)方面可能更具有信息性。土壤微生物的進一步研究應(yīng)該結(jié)合微生物群落的絕對數(shù)量和相對豐度來進行不同地點的比較，因此細菌的絕對定量分析對于微生物群落的研究未來是非常重要的。

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