Nature Microbiology：腸道菌群重塑腸上皮細(xì)胞DNA甲基化以控制腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥

發(fā)稿時(shí)間：2020-03-10來源：天昊生物

 

英文題目: The microbiota programs DNA methylation to control intestinal homeostasis and inflammation

中文題目：腸道菌群重塑腸上皮細(xì)胞DNA甲基化以控制腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥

期刊名：Nature Microbiology

影響因子：14.3

發(fā)表時(shí)間：2020年2月

單位: 以色列希伯來大學(xué)醫(yī)學(xué)院

研究摘要:

盡管已經(jīng)對(duì)腸道微生物的多樣性進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)其在正常和致病條件下如何影響腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的研究還很少。表觀遺傳學(xué)機(jī)制最近被認(rèn)為是在微生物群和腸上皮細(xì)胞（IEC）基因組之間相互交流的介質(zhì)。我們對(duì)常規(guī)飼養(yǎng)和無菌小鼠進(jìn)行了全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序( WGBS )，發(fā)現(xiàn)暴露于共生微生物群會(huì)導(dǎo)致調(diào)控元件的局部DNA甲基化改變，這種改變是依賴于去甲基化酶TET2/3的，這最終激活了一組“早期前哨”反應(yīng)基因，以維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，我們還證明，葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性炎癥暴露于微生物群會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)元件的DNA甲基化和開放染色質(zhì)的變化，從而導(dǎo)致結(jié)腸炎和結(jié)腸癌相關(guān)功能基因表達(dá)程序的改變。最后，通過基因干預(yù)，我們證明了微生物群誘導(dǎo)的表觀遺傳重塑對(duì)于維持體內(nèi)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)是必要的。

研究背景:

DNA甲基化是一種化學(xué)標(biāo)記系統(tǒng)，通過影響蛋白質(zhì)結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，引起基因表達(dá)的變化，來注釋遺傳信息。表觀遺傳學(xué)機(jī)制最近被認(rèn)為是在微生物群和腸上皮細(xì)胞（IEC）之間相互交流的介質(zhì)，并且在炎癥性腸?。?span>IBD）的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。腸道炎性疾病會(huì)引起許多與健康有關(guān)的問題，并降低生活質(zhì)量。全基因組相關(guān)研究已將160多個(gè)遺傳易感位點(diǎn)與IBD聯(lián)系起來,然而這些基因座中的絕大多數(shù)以低優(yōu)勢(shì)比（1-1.15）促進(jìn)疾病的發(fā)展，這表明基因組遺傳對(duì)IBD的貢獻(xiàn)更為有限。此外，對(duì)同卵雙胞胎的實(shí)驗(yàn)顯示，成對(duì)內(nèi)IBD的一致性低于50%，因此人們普遍認(rèn)為環(huán)境因素可能在IBD的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，在正常發(fā)育和疾病發(fā)病過程中涉及表觀遺傳機(jī)制，如組蛋白修飾和DNA甲基化。腸道微生物群通過改變宿主基因在整個(gè)腸道中的表達(dá)來調(diào)節(jié)腸道生理，但其潛在的機(jī)制尚未闡明。先前發(fā)表的全基因組組蛋白修飾分析表明，微生物群調(diào)節(jié)了幾個(gè)腸細(xì)胞免疫亞群的染色質(zhì)譜。我們現(xiàn)在分析了正常和急性炎癥條件下共生細(xì)菌對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞（IEC）表觀遺傳DNA甲基化譜的影響。

研究結(jié)果：

微生物群誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化

為了確定共生菌群對(duì)腸道上皮細(xì)胞宿主基因轉(zhuǎn)錄的影響，分析了從小鼠結(jié)腸隱窩分離的腸上皮細(xì)胞（IECs）的mRNA轉(zhuǎn)錄組，比較了在沒有微生物的情況下出生后飼養(yǎng)的無菌（GF）小鼠與在有微生物的情況下出生后飼養(yǎng)的年齡和性別匹配的常規(guī)（CNV）小鼠。數(shù)據(jù)分析顯示免疫基因表達(dá)無普遍差異，FACS分析顯示，在結(jié)腸隱窩IECs的制備過程中，免疫細(xì)胞的貢獻(xiàn)較低，說明免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)可忽略不計(jì)。主成分分析顯示三個(gè)常規(guī)（CNV）小鼠與三個(gè)無菌（GF）小鼠之間有很大的相似性。差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在CNV和GF樣本中，有824個(gè)基因顯著上調(diào)，358個(gè)基因下調(diào)，表明有大量基因表達(dá)被微生物調(diào)控。358個(gè)下調(diào)基因的GO功能分析顯示細(xì)胞外基質(zhì)和代謝過程富集。824個(gè)上調(diào)基因的通路分析顯示，參與有絲細(xì)胞分裂的基因顯著富集，與先前公布的數(shù)據(jù)一致，表明無菌（GF）小鼠腸細(xì)胞的隱窩更新率減弱。與這一發(fā)現(xiàn)一致，常規(guī)（CNV）小鼠隱窩中增殖標(biāo)記物的表達(dá)水平顯著增加。總之，研究結(jié)果清楚地表明，腸上皮細(xì)胞（IECs）暴露于細(xì)菌中對(duì)腸道上皮細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)方面都有顯著影響。

微生物群導(dǎo)致調(diào)控元件的表觀遺傳深刻變化

為了確定微生物群對(duì)宿主全基因組DNA甲基化的影響，我們對(duì)結(jié)腸隱窩腸上皮細(xì)胞（IECs）進(jìn)行了全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS），數(shù)據(jù)分析顯示，與無菌（GF）小鼠相比，常規(guī)（CNV）小鼠樣本中的整體甲基化水平顯著降低（圖1a）。還比較了啟動(dòng)子和峽谷（發(fā)現(xiàn)人基因組中，存在保守的、大范圍的低甲基化區(qū)域，泛癌超高甲基化的峽谷區(qū)與基因激活顯著相關(guān)）的甲基化水平，這兩個(gè)調(diào)控特征通常與基因的5'區(qū)域相關(guān)，并確定了輕微但可重復(fù)的甲基化變化。我們?cè)跀?shù)據(jù)集中識(shí)別了低甲基化區(qū)域（LMRs，代表基因調(diào)節(jié)活躍區(qū)域）。CNV樣本包含約93000個(gè)低甲基化區(qū)域（LMRs），而GF樣本僅包含約57000個(gè)低甲基化區(qū)域（LMRs）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，從CNV小鼠分離的結(jié)腸隱窩IECs中12983個(gè)LMRs的甲基化水平降低（指定為低甲基化LMRs，hypomethylated LMRs），而只有3115個(gè)LMRs的甲基化水平升高（指定為高甲基化LMRs，hypermethylated LMRs）（圖1b）。我們還通過對(duì)來自其它小鼠的GF和CNV結(jié)腸隱窩DNA以及FACS分類的IECs進(jìn)行靶向亞硫酸氫鹽分析來驗(yàn)證我們的WGBS數(shù)據(jù)，兩個(gè)結(jié)果是相似的。我們的研究結(jié)果表明，暴露在微生物群中會(huì)引起諸如LMRs等調(diào)控元件的深刻表觀遺傳變化。

由于LMRs往往使DNA甲基化變化與基因表達(dá)變化重疊，我們將重點(diǎn)放在基因內(nèi)LMRs上，它允許將單個(gè)LMRs分配給特定的基因，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與基因表達(dá)改變相關(guān)的LMRs都處于低甲基化（hypomethylation）。我們進(jìn)一步關(guān)注那些在CNV小鼠中變得低甲基化，并且表現(xiàn)出顯著表達(dá)增加的300個(gè)LMRs（圖1c），結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些低甲基化LMRs高度顯著富集在三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族（FoxA、Eklf和AP1）的結(jié)合位點(diǎn)，這表明這組轉(zhuǎn)錄因子參與整合微生物群相關(guān)信號(hào)（圖1d）。事實(shí)上，FoxA和Eklf轉(zhuǎn)錄因子在腸道發(fā)育、形態(tài)學(xué)和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，而AP1轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖、分化、炎癥、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞遷移和凋亡中起著關(guān)鍵作用。

GO分析顯示在CNV小鼠中上調(diào)表達(dá)的300個(gè)基因主要富集在“小鼠結(jié)腸炎”、“人類炎癥性腸病”和“人類衰老”等功能（圖1e）。對(duì)這三類上調(diào)基因的檢測(cè)表明，暴露于共生微生物群會(huì)導(dǎo)致LMR去甲基化和一組早期炎癥基因（即“前哨炎癥基因”）的轉(zhuǎn)錄激活，這些前哨炎癥基因可能會(huì)驅(qū)動(dòng)正常的腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這組基因包括IFITM3（上調(diào)2.9倍）、NOS2（上調(diào)15.6倍）和PLA2G2A（上調(diào)15.5倍），它們都是由微生物引起的，參與抗菌和抗炎反應(yīng)。

圖1從GF小鼠和CNV小鼠分離的結(jié)腸隱窩細(xì)胞的WGBS測(cè)序

 

CNV小鼠急性結(jié)腸炎誘導(dǎo)DNA低甲基化

給藥葡聚糖硫酸鈉（DSS）可改變腸粘液層，使細(xì)菌在12小時(shí)內(nèi)滲入內(nèi)層。因此，我們用DSS治療小鼠，以增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞（IECs）對(duì)微生物群的暴露，正如預(yù)期的那樣，DSS治療的小鼠表現(xiàn)出各種腸道損傷和炎癥癥狀（圖2a-f）。然后我們使用WGBS詳細(xì)分析了DSS相關(guān)的DNA甲基化變化，結(jié)果表明，在DSS處理的CNV樣品（圖2g）中，特別是在層板相關(guān)結(jié)構(gòu)域LAD（LADs形成了一種染色質(zhì)抑制狀態(tài)，有幾千個(gè)基因位于LADs內(nèi)，其中大部分基因都處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)）中，整體甲基化水平降低。這些結(jié)果表明，單劑量DSS處理會(huì)導(dǎo)致基因組具有大的低甲基化區(qū)域，這些區(qū)域與后期復(fù)制結(jié)構(gòu)域（部分甲基化結(jié)構(gòu)域（PMDs））相關(guān)。

對(duì)WGBS（GF小鼠VS CNV小鼠腸上皮細(xì)胞）和RNA-seq（GF小鼠VS CNV小鼠腸上皮細(xì)胞）數(shù)據(jù)集（在3個(gè)生物復(fù)制體上進(jìn)行）的綜合分析確定了251個(gè)啟動(dòng)子，它們改變了甲基化水平，并顯著改變了相關(guān)基因的表達(dá)水平（大于2倍）。值得注意的是，這些基因中的大多數(shù)（185）在DSS處理的CNV小鼠中被激活，并且這些基因含有在急性炎癥中發(fā)生低甲基化的啟動(dòng)子。有趣的是，通路分析顯示，上調(diào)的低甲基化基因主要富集在免疫細(xì)胞趨化性和炎癥反應(yīng)等重要功能方面。FACS和RNA-seq顯示DSS樣本中免疫細(xì)胞的貢獻(xiàn)率較低，提示觀察到的基因表達(dá)變化可能是IECs的表觀遺傳重塑所致。

圖2 急性炎癥中甲基化變化對(duì)基因表達(dá)的影響

 

急性結(jié)腸炎引起表觀遺傳調(diào)控因子的深刻變化

為了進(jìn)一步解釋依賴于CNV/DSS的變化，我們分析了LMR甲基化水平，在131133個(gè)LMR中，20061個(gè)在CNV/DSS樣本中高甲基化（甲基化差異>0.1），而14585個(gè)低甲基化。當(dāng)從分析中排除分化相關(guān)的LMR時(shí)，得到了非常相似的結(jié)果（圖2h），表明分化相關(guān)的LMR對(duì)炎癥誘導(dǎo)的甲基化變化沒有顯著貢獻(xiàn)。炎癥相關(guān)的甲基化變化通常延伸到LMR的整個(gè)長(zhǎng)度（圖2i）。最后，差異甲基化的LMR對(duì)于增強(qiáng)染色質(zhì)標(biāo)記H3K4me1和H3K27ac（大多數(shù)H3K4me1修飾富集在增強(qiáng)子區(qū)域，H3K27ac主要富集在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域，當(dāng)增強(qiáng)子區(qū)只有H3K4me1修飾富集時(shí)，該增強(qiáng)子處于平衡狀態(tài)，而當(dāng)增強(qiáng)子區(qū)域同時(shí)富集H3K4me1和H3K27ac修飾時(shí)，該增強(qiáng)子就處于激活狀態(tài)促進(jìn)基因表達(dá)）明顯富集，而對(duì)于活性啟動(dòng)子標(biāo)記H3K4me3（H3K4me3在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的出現(xiàn)有明顯峰值，而這高峰值也一直被認(rèn)為與基因表達(dá)調(diào)控息息相關(guān)）則強(qiáng)烈缺失（圖2j），總之，這些結(jié)果表明急性炎癥在特定增強(qiáng)劑區(qū)域誘導(dǎo)了深刻的表觀遺傳變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在DSS處理的CNV小鼠中，373個(gè)基因的一個(gè)子集的表達(dá)顯著上調(diào)，并且LMRs發(fā)生了低甲基化，這些基因顯示了免疫反應(yīng)途徑的顯著富集（圖2k）。

與差異表達(dá)基因相關(guān)的LMRs顯著富集在多種預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括兩種炎癥反應(yīng)的典型因子：NF-κB和AP1（圖2l，m）。NF-κB結(jié)合位點(diǎn)在與上調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMRs中富集3.4倍，在與下調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMRs中富集5.5倍，這與NF-κB作為轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子的雙重功能一致；高甲基化LMRs則沒有富集現(xiàn)象，這與選擇性炎癥誘導(dǎo)的NF-κB與低甲基化LMRs的結(jié)合一致。AP1結(jié)合位點(diǎn)在與上調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMRs中富集11.3倍，在與下調(diào)基因相關(guān)的低甲基化LMRs中富集8.8倍，這與NF-κB作為轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子的雙重功能一致；高甲基化LMRs的類似富集情況則沒有發(fā)現(xiàn)，這與選擇性炎癥誘導(dǎo)的NF-κB與低甲基化LMRs的結(jié)合一致，同樣，高甲基化LMRs也沒有富集現(xiàn)象。DSS在含有NF-κB或AP1結(jié)合位點(diǎn)的LMR處誘導(dǎo)的低甲基化非常明顯，并延伸到LMR的整個(gè)長(zhǎng)度。因此，由粘膜屏障破壞引起的急性炎癥在增強(qiáng)子區(qū)域引起廣泛的甲基化改變，這與主要炎癥轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的活性改變有關(guān)。

圖2 急性炎癥中甲基化變化對(duì)基因表達(dá)的影響

急性炎癥CNV小鼠開放染色質(zhì)、甲基化和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的重疊

由于表達(dá)通常與開放染色質(zhì)的局部變化相關(guān)，我們進(jìn)行了全基因組的ATAC-seq分析，在CNV小鼠中鑒定出469個(gè)顯著差異峰，在DSS/CNV-IECs中鑒定出21925個(gè)顯著差異峰。在后者中，4122個(gè)與低甲基化CNV/DSS特異性LMRs重疊（圖3a），后者與391個(gè)顯著上調(diào)的基因相關(guān)。這些基因在小鼠（圖3b）以及人類結(jié)腸炎和結(jié)腸癌（圖3c）的急性和先天性炎癥反應(yīng)中富集，證實(shí)了全基因組甲基化分析。

圖3 小腸結(jié)腸炎的ATAC-seq分析

 

值得注意的是，AP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在這些ATAC-seq峰中高度富集（圖3d）。這組基因的一個(gè)例子是Myd88。它與DSS處理的CNV小鼠中的低甲基化LMR、DSS特有的ATAC-seq峰和活化表達(dá)有關(guān)（圖3e）。Myd88作為Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游轉(zhuǎn)接器蛋白參與細(xì)菌的感知和功能，包括已知與細(xì)菌脂多糖（LPS）相互作用的TLR4。因此，我們的研究結(jié)果表明，宿主腸上皮基因的微生物群相關(guān)調(diào)控與染色質(zhì)開放有關(guān)。

圖3 小腸結(jié)腸炎的ATAC-seq分析

 

急性炎癥不依賴于微生物群

為了找出CNV/DSS中觀察到的表觀遺傳變化是否是由于細(xì)菌暴露引起的，我們用DSS處理GF小鼠從而引起腸道損傷和炎癥（圖4a-c）。RNA-seq數(shù)據(jù)分析僅發(fā)現(xiàn)193個(gè)基因在GF/DSS和GF樣本中表達(dá)水平發(fā)生顯著變化：114個(gè)基因上調(diào)，79個(gè)基因下調(diào)。這些基因與部分在DSS處理CNV小鼠中上調(diào)和下調(diào)的基因共享（圖4d），這表明DSS依賴的“核心”效應(yīng)。相比之下，CNV/DSS小鼠中只有5%的基因受到GF/DSS小鼠的影響。這表明DSS處理中觀察到的相當(dāng)大的表達(dá)變化是由微生物群引起的。

為了研究在沒有微生物群的情況下與DSS處理相關(guān)的甲基化變化，再次進(jìn)行了WGBS測(cè)序，排除與分化相關(guān)的LMRs后，我們?cè)?span>GF/DSS樣品中鑒定出7388個(gè)高甲基化LMRs，與未處理的GF小鼠相比，鑒定出5628個(gè)低甲基化LMRs（圖4e）。WGBS分析的結(jié)果通過靶向亞硫酸氫鹽甲基化分析得到證實(shí)，并且結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)在CNV/DSS小鼠中觀察到的變化在GF/DSS小鼠中不存在。后將單個(gè)LMRs分配給特定基因后，發(fā)現(xiàn)只有39個(gè)LMRs在DSS處理的GF小鼠中變得低甲基化，并且顯示出顯著的表達(dá)增加，在DSS處理的GF小鼠中，94個(gè)LMRs發(fā)生了高甲基化，并顯示出顯著的表達(dá)降低。這些結(jié)果證實(shí)了DSS在沒有微生物群的情況下有相當(dāng)溫和的效果。此外，當(dāng)將在GF/DSS中改變的LMRs的相關(guān)基因與在CNV/DSS中改變的LMRs的相關(guān)基因進(jìn)行比較時(shí)，我們僅識(shí)別出44個(gè)重疊基因（圖4f）。這些結(jié)果表明，DSS處理在沒有微生物群的情況下產(chǎn)生了非常小的DNA甲基化依賴性的表達(dá)變化。

最后，為了解決出生后DNA甲基化與腸道微生物群之間的直接聯(lián)系，我們進(jìn)行了糞便移植實(shí)驗(yàn)，使GF小鼠常規(guī)化，同時(shí)將其保存在無菌隔離器中，重新建立共生微生物群后會(huì)顯著降低DNA甲基化（圖4g）。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了微生物群在穩(wěn)態(tài)和炎癥條件下觀察到的表觀遺傳規(guī)劃效應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

圖4無微生物群時(shí)炎癥結(jié)腸的基因表達(dá)和甲基化變化

微生物群誘導(dǎo)去甲基化的分子機(jī)制

胚胎發(fā)生早期的去甲基化是由TET酶的組合介導(dǎo)的，TET酶羥基化5mC。為了測(cè)試微生物群誘導(dǎo)的結(jié)腸去甲基化是否以類似的方式完成，我們最初分析了從CNV小鼠結(jié)腸隱窩IECs分離的RNA序列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TET1不表達(dá)，而TET2和TET3（TET2/3）表達(dá)。然后，我們檢測(cè)了來自GF和CNV的結(jié)腸隱窩IECs的TET2/3表達(dá)水平是否存在差異。事實(shí)上，TET3（而不是TET2）在CNV中的表達(dá)明顯高于GF。此外，用抗生素治療CNV小鼠可將TET3表達(dá)降低至GF水平，而DSS治療小鼠和LPS治療結(jié)腸有機(jī)物可上調(diào)TET3表達(dá)水平，將腸道微生物群與TET3表達(dá)聯(lián)系起來。

因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們將Tet2/3^fl/fl小鼠與腸特異性絨毛蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)CRE重組酶的動(dòng)物雜交，從而獲得在腸上皮中這些酶的組織特異性敲除小鼠（Tet2/3 ^fl/fl VillinCre）。然后我們從指定野生型（Tet2/3 ^fl/fl）和Tet2/3 ^fl/fl VillinCre 敲除小鼠的結(jié)腸中分離出隱窩IECs，并進(jìn)行WGBS，結(jié)果表明，Tet2/3 ^fl/fl VillinCre 敲除小鼠的整體甲基化水平顯著升高（圖5a），在6個(gè)微生物群誘導(dǎo)的低甲基化LMRs（圖5b）上通過靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了這一點(diǎn)。這些結(jié)果表明TET2/3在微生物誘導(dǎo)的脫甲基過程中起著關(guān)鍵作用。

對(duì)Tet2/3 ^fl/fl VillinCre 敲除小鼠中六個(gè)與高甲基化LMRs相關(guān)的基因的RT-PCR分析表明，在所有突變動(dòng)物中，三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄顯著降低（圖5c），表明TET2/3介導(dǎo)的這些調(diào)控序列的去甲基化在基因誘導(dǎo)中起直接作用。另外三個(gè)基因在突變小鼠中則顯示出可變的表達(dá)，這表明這些LMRs要么不調(diào)節(jié)其相關(guān)基因，要么涉及額外的調(diào)節(jié)因子。

為了研究TET2/3缺失是否抑制去甲基化反應(yīng)，我們對(duì)5個(gè)DSS誘導(dǎo)的低甲基化LMRs進(jìn)行了靶向亞硫酸氫鹽測(cè)序，結(jié)果表明，與Tet2/3 ^fl/fl小鼠相比，DSS處理的Tet2/3 ^fl/fl VillinCre小鼠的所有受試LMRs均未能去甲基化（圖5d）。此外，Tet2/3 ^fl/fl VillinCre突變體比Tet2/3^fl/fl小鼠更易受DSS處理的影響，如疾病活動(dòng)、體重減輕和組織學(xué)分析所證明（圖5e-h），這與TET2/3介導(dǎo)的微生物依賴性去甲基化以及突變小鼠對(duì)炎癥挑戰(zhàn)的反應(yīng)低于野生動(dòng)物的觀點(diǎn)一致。

圖5  微生物群誘導(dǎo)去甲基化的分子機(jī)理